Zestawy ChIC/CUT&RUN
- Interakcje białko-DNA i metoda immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)
- Przegląd ChIC i CUT&RUN przy użyciu zmodyfikowanej mikrokokowej nukleazy DNA (MNase)
- ChIC/CUT&RUN wprowadzenie zestawów
- Dane aplikacyjne dla zestawów ChIC/CUT&RUN
- Narzędzie do analizy danych ChIC i CUT&RUN
Interakcje białko-DNA i metoda immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)
Interakcje białko-DNA są niezbędne w wielu procesach biologicznych, takich jak replikacja i naprawa DNA, transkrypcja i regulacja ekspresji genów. Zrozumienie specyficzności, z jaką białka wiążą się z sekwencjami DNA w różnych warunkach fizjologicznych ma istotne znaczenie. Wśród wielu technik badających interakcje białko-DNA, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest szeroko stosowana do badania interakcji białko-DNA. Kiedy badacze wykorzystują ChIP, komórki są sieciowane formaldehydem, chromatyna jest fragmentowana i rozpuszczana, a immunoprecypitacja jest stosowana do rozpuszczonej chromatyny. Chociaż metody odczytu ChIP ewoluowały na przestrzeni lat, od końcowego PCR do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, podstawy ChIP pozostały niezmienione. Jednak nadal istnieją problemy związane z tą techniką, w tym wysokie tło, które ogranicza czułość, wyzwania związane z dużą ilością danych komórkowych oraz artefakty wynikające z sieciowania i solubilizacji białek.
Overview of ChIC and CUT&RUN using a modified micrococcal DNA nuclease (MNase)
.Stawiając czoła wyzwaniom związanym z wykorzystaniem techniki ChIP w przypadku nierozpuszczalnych białek, naukowcy opracowali elegancką alternatywną strategię określaną jako immunocleavage chromatyny (ChIC)1. ChIC wykrywa miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych w genomie poprzez celowanie w zmodyfikowaną nukleazę mikrokokową (MNase), skoniugowaną z białkiem A (pA-MN), przy użyciu specyficznego przeciwciała. Zmodyfikowana MNaza specyficznie rozszczepia DNA w regionach oddziałujących z interesującym białkiem tylko wtedy, gdy obecne są jony Ca2+, co pozwala na kontrolowane rozszczepienie DNA w miejscu wiązania przeciwciała. Podejście to pozwala na mapowanie białek z rozdzielczością 100-200 bp i doskonałą specyficznością w porównaniu do konwencjonalnych metod ChIP 1.
Adaptując ChIC, naukowcy zoptymalizowali protokół i połączyli ChIC z głębokim sekwencjonowaniem w celu wykrycia miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie i modyfikacji histonów na natywnej chromatynie z rozdzielczością <5 bp. Ta metoda łącząca ChIC z głębokim sekwencjonowaniem jest określana jako Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN)2.
W metodach ChIC i CUT&RUN tylko docelowe fragmenty są uwalniane do roztworu, podczas gdy większość DNA pozostaje, co prowadzi do wyjątkowo niskiego poziomu tła (Rysunek 1).
Rysunek 1: Przegląd metod ChIC i CUT&RUN.Aby wykonać ChIC i CUT&RUN, komórki są zbierane i wiązane z kulkami magnetycznymi pokrytymi konkanawaliną A. Błony komórkowe są permeabilizowane digitoniną, aby umożliwić specyficznemu przeciwciału znalezienie celu. Po inkubacji z przeciwciałem, kulki są krótko płukane i inkubowane z pA-MN. Komórki są schładzane do temperatury 0°C, a trawienie rozpoczyna się od dodania buforu inkubacyjnego zawierającego Ca2+. Reakcje są zatrzymywane przez chelatowanie, a fragmenty DNA uwolnione do roztworu w wyniku rozszczepienia są ekstrahowane z supernatantu.
W rezultacie ChIC i CUT&RUN dostarcza wysokiej jakości dane przy użyciu zaledwie 100 komórek do analizy modyfikacji histonów i 1000 komórek do analizy miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego. W przeciwieństwie do ChIP, ChIC i CUT&RUN jest wolny od problemów związanych z rozpuszczalnością i artefaktami dostępności DNA wynikającymi z sieciowania. ChIC i CUT&RUN przewyższa ChIP pod względem rozdzielczości, stosunku sygnału do szumu i wymaganej głębokości sekwencjonowania. Poniżej znajduje się tabela podsumowująca zalety ChIC i CUT&RUN w porównaniu z X-ChIP-seq (Tabela 1).
Wprowadzenie do zestawów ChIC/CUT&RUN
Opracowaliśmy trzy zestawy ChIC/CUT&RUN (Cat. #CHR100-102) w oparciu o techniki ChIC i CUT&RUN, z dodatkiem koktajlu białkowego pG-MN lub pA-MN/pG-MN, aby zapewnić więcej opcji wyboru przeciwciał. pA-MN ma wyższe powinowactwo do większości przeciwciał, w tym króliczych IgG, podczas gdy pG-MN jest bardziej odpowiedni dla przeciwciał o niskim powinowactwie do białka A, na przykład mysich IgG1.
Zestawy te zapewniają następujące korzyści dla profilowania interakcji białek chromatyny w całym genomie:
- Niezwykle niski stosunek sygnału do szumu w porównaniu do sieciowania ChIP-seq
- Usunięcie etapów sieciowania, sonikacji i szybkiego wirowania
- Zmniejszenie wymaganej liczby komórek wyjściowych (minimum 100 komórek dla modyfikacji histonów i 1000 komórek dla czynnika transkrypcyjnego)
- Znacznie skrócony czas procedury - od komórek do oczyszczonego DNA w ciągu jednego dnia (minimum 3 godziny)
- Nie wymaga specjalnego sprzętu
Zestawy ChIC/CUT&RUN mogą być używane do wielu podstawowych Zestawy ChIC/CUT&RUN mogą być używane w wielu podstawowych i translacyjnych zastosowaniach, w których dostępna jest tylko ograniczona liczba komórek (standardowe protokoły ChIP z wiązaniem krzyżowym nie nadają się do tego zastosowania), takich jak badania biologii rozwojowej oraz analiza próbek klinicznych lub komórek uzyskanych po sortowaniu lub sekcji komórek aktywowanych fluorescencją. Dzięki wyeliminowaniu sonikacji i etapów wirowania z dużą prędkością w celu usunięcia nierozpuszczalnych materiałów i przyłączenia komórek do kulek magnetycznych, zestawy ChIC/CUT&RUN mogą być potencjalnie wykorzystywane również do zastosowań o wysokiej wydajności.
Dane aplikacyjne dla zestawów ChIC/CUT&RUN
Poniżej przedstawiono wyniki sekwencjonowania po wykonaniu testu ChIC i CUT&RUN przy użyciu zestawów ChIC/CUT&RUN (Rysunek 2-3).
Rysunek 2: Wyniki sekwencjonowania dla testu ChIC i CUT&RUN (H3K27me3).Test ChIC i CUT&RUN przeprowadzono z użyciem przeciwciała anty-H3K27me3 i 2x105 komórek (1. ścieżka). Wyniki porównano z opublikowanymi wynikami testu CUT&RUN (2. ścieżka) i danymi ENCODE ChIP-seq (3. ścieżka) 2. Wyniki anty-H3K4me3 ChIP-seq z ENCODE są również pokazane jako kontrola negatywna (4. ścieżka).
Rysunek 3.Wyniki sekwencjonowania testu ChIC/CUT&RUN (CTCF). Test ChIC i CUT&RUN przeprowadzono przy użyciu przeciwciała anty-CTCF (nr kat.: 07-729) i 2x105 komórek K562 (1. ścieżka). Wyniki te porównano z opublikowanymi wynikami testu CUT&RUN (GSE104550) (2. ścieżka) i danymi ENCODE ChIP-seq (GSM749690) z tym samym przeciwciałem (3. ścieżka) 2.
Narzędzie do analizy danych ChIC i CUT&RUN
Rozumiemy, że nawet po przeprowadzeniu udanego eksperymentu ChIC i CUT&RUN, nadal możesz napotkać wyzwania związane z przetwarzaniem i analizą uzyskanych danych.Dlatego stworzyliśmy narzędzie do analizy danych ChIC i CUT&RUN, aby umożliwić samodzielną analizę danych. Narzędzie to zostało opracowane w oparciu o powszechnie stosowane i zweryfikowane algorytmy, takie jak MACS2 do wywoływania pików, z uwzględnieniem braku lub obecności replikatów i kodów kreskowych. Narzędzie jest bardzo łatwe w użyciu, nie wymaga wcześniejszego doświadczenia z bioinformatyką i jest bezpłatne dla klientów zestawu ChIC/CUT&RUN .
Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Przegląd narzędzia do analizy danych ChIC i CUT&RUN oraz FAQ narzędzia do analizy danych ChIC i CUT&RUN. Identyfikator zamówienia można znaleźć na dowodzie dostawy, potwierdzeniu zamówienia lub uzyskać, dzwoniąc do lokalnego działu obsługi klienta.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?