Wpływ wstępnego przechowywania próbek środowiskowych na wyniki zliczania

Monitorowanie środowiska przy użyciu pożywek hodowlanych w postaci osadów i płytek kontaktowych jest kluczową częścią aseptycznego wytwarzania produktów farmaceutycznych. Pobieranie próbek pożywek hodowlanych jest zwykle przeprowadzane w pomieszczeniach czystych, a następnie przenoszone do laboratorium w celu inkubacji i oceny wyników. Proces produkcyjny nie zawsze pozwala na natychmiastowe przeniesienie próbek do inkubatora.

W artykule omówiono interesujące dane dotyczące przepływu pracy z próbkami środowiskowymi w pomieszczeniach czystych. Większość techników laboratoryjnych nie ma odpowiednich możliwości przenoszenia próbek bezpośrednio do inkubatora. Próbki są wstępnie przechowywane w pomieszczeniu czystym lub w lodówce przed rozpoczęciem procesu inkubacji. Dane przedstawione w tym artykule pokażą, czy wstępne przechowywanie ma jakikolwiek wpływ na wskaźniki odzysku i promocję wzrostu wybranych mikroorganizmów.

• Interim Storage Conditions
• Influence of Interim Storage on Selected Microorganisms vs. Direct Inoculation
• in situ Surface Sampling using ICR Plus Contact Plates
• Przydatność warunków wstępnego przechowywania próbek środowiskowych
• Powiązane produkty

Warunki tymczasowego przechowywania

Wpływ różnych warunków tymczasowego przechowywania jest badany w oparciu o następujące kryteria:

• Wzrost wybranych mikroorganizmów
• pobranie próbek powierzchniowych in situ na naturalnie zanieczyszczonych powierzchniach<

Do tego badania jako podłoże testowe wybrano napromieniowany promieniami gamma agar kazeinowy (TSA) z 4 neutralizatorami (TSA w. LTHThio Contact ICR+; Nr produktu  146783).

Wewnętrzne warunki przechowywania zostały wybrane w oparciu o różne praktyki laboratoryjne i są wymienione poniżej:

1. Próbka jest bezpośrednio inkubowana w temperaturze od 30 °C do 35 °C po pobraniu próbki powierzchniowej lub inokulacji.
2. Próbka jest przechowywana w temperaturze pokojowej przez 16 do 18 godzin po pobraniu próbki powierzchniowej lub inokulacji, a następnie inkubowana w temperaturze od 30 °C do 35 °C.
3. Próbka jest przechowywana w temperaturze od 4 °C do 8 °C przez 2 godziny po pobraniu próbek powierzchniowych lub inokulacji, a następnie inkubowana w temperaturze od 30 °C do 35 °C.
4. Próbka jest przechowywana w temperaturze od 4 °C do 8 °C przez 6 godzin po pobraniu próbek powierzchniowych lub inokulacji, a następnie inkubowana w temperaturze od 30 °C do 35 °C.
5. Próbka jest przechowywana w temperaturze od 4 °C do 8 °C przez 16 do 18 godzin po pobraniu próbek powierzchniowych lub inokulacji, a następnie inkubowana w temperaturze od 30 °C do 35 °C.
6. Próbka jest przechowywana w temperaturze od 4 °C do 8 °C przez >55 godzin po inokulacji, a następnie inkubowana w temperaturze od 30 °C do 35 °C.

Badanie wpływu warunków wstępnego przechowywania próbek na szybkość odzyskiwania i promocję wzrostu

Część I: Wpływ tymczasowego przechowywania na wybrane mikroorganizmy vs. bezpośrednia inokulacja

Bezpośrednia inokulacja

Szczepy testowe zostały wybrane na podstawie ich ogólnego występowania w pomieszczeniach czystych,³ ich związku z mikrobiomem ludzkiej skóry² oraz zaleceń farmakopei USA i UE dotyczących testów promocji wzrostu na pożywkach agarowych z kazeiną sojową.^1,4 Listę wybranych szczepów i warunki inkubacji po pobraniu próbek oraz warunki bezpośredniego przechowywania podano w Tabeli 1.

.

Tabela 1. Wybrane szczepy testowe i warunki inkubacji.

Szczep testowy	Numer ATCC®	.Bezpośrednie warunki inkubacji (z wyłączeniem tymczasowych warunków przechowywania)
Staphylococcus aureus	6538	Aerobowe; 24 godziny w 30-35 °C
Kocuria rhizophila	9341	Aerobowe; 48 godzin w 30-35 °C
Staphylococcus epidermidis	14990	Aerobowe; 48 godzin w 30-35 °C
Propionibacterium acnes	6919	Beztlenowe; 10 dni w temp. 30-35 °C
Corynebacterium striatum	7094	Aerobowe; 48 godzin w 30-35 °C
Escherichia coli	25922	Aerobowe; 24 godziny w 30-35 °C
Penicillium commune	10428	Aerobowe; 5 dni w temperaturze 30-35 °C
Próbki powierzchniowe		Aerobowe; 3 dni w temperaturze 30-35 °C

Przygotowano inokulum świeżych kultur nocnych i rozcieńczono do uzyskania ok. 10-120 CFU, które następnie zaszczepiono na powierzchni płytek testowych. Każdy warunek testowy został przeprowadzony w dwóch niezależnych seriach testowych z pięciokrotnym powtórzeniem w każdej serii. W przypadku tymczasowego przechowywania przez 55 godzin w temperaturze od 4°C do 8°C przeprowadzono tylko jeden test. Współczynniki odzysku zostały obliczone na podstawie średniej liczby CFU na płytkach bez tymczasowego przechowywania.

Współczynnik odzysku = (CFU - test) × 100 / (CFU - bezpośrednia inkubacja)

Zaobserwowano, że współczynniki odzysku w dwóch niezależnych rundach wykazywały te same trendy. W związku z tym na rysunkach 1 i 2 przedstawiono wyniki tylko dla jednej rundy testowej. Wyniki dla tlenowych szczepów testowych pokazano na Rysunku 1.

Rysunek 1. Wskaźniki odzysku wybranych mikroorganizmów po każdym okresie przechowywania w porównaniu do bezpośredniej inkubacji.

Ponadto, tymczasowe przechowywanie dla Propionibacterium acnes przeprowadzono zarówno w warunkach beztlenowych, jak i tlenowych. Wyniki dla tego szczepu testowego przedstawiono na Rysunku 2.

.

Rysunek 2. Wskaźniki odzysku Propionibacterium acnes po każdym okresie przechowywania w porównaniu do bezpośredniej inkubacji.

Część II: in situ pobieranie próbek powierzchni przy użyciu płytek kontaktowych ICR plus

Próbki powierzchni pobrano z niesklasyfikowanego środowiska laboratoryjnego w 20 rzędach i 5 pozycjach w rzędzie przy użyciu płytki kontaktowej TSA w. LTHThio Contact ICR+ (nr produktu 146783). Schemat pobierania próbek i różne warunki tymczasowego przechowywania przedstawiono na Rysunku 3. Płytki te inkubowano przez 3 dni w temperaturze od 30 °C do 35 °C zgodnie z warunkami przechowywania tymczasowego. Na koniec policzono kolonie i dokonano porównania dla każdego z tymczasowych warunków przechowywania.

Rysunek 3. Wzór próbkowania dla pierwszych 5 rzędów (rzędy od 6 do 20 będą powtarzać ten wzór co 5 rzędów).

Średnia wszystkich próbek testowych jest porównywalna dla większości warunków tymczasowego przechowywania z 10 lub 11 CFU. Dłuższe tymczasowe przechowywanie przez 16 do 18 godzin w niskich temperaturach skutkowało niższym wskaźnikiem odzysku ze średnią 6 CFU. Jest to wskazane na Rysunku 4 dla wszystkich wyników testów dla każdego warunku tymczasowego. Wydaje się, że chłodne warunki przechowywania mogą zmniejszyć odzyskiwanie niektórych mikroorganizmów, które nie rosną prawidłowo po inkubacji.

Rysunek 4. Odzyskiwanie mikroorganizmów w każdej tymczasowej temperaturze przechowywania.

Przydatność warunków wstępnego przechowywania próbek środowiskowych: Wnioski

W niniejszym badaniu ustalono, że różne warunki wstępnego przechowywania nie miały wpływu na wskaźnik odzysku wybranych mikroorganizmów (.Staphylococcus aureus, Kocuria rhizophila, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Corynebacterium striatum, Escherichia coli i Penicillium commune) przed standardowym okresem inkubacji. Stwierdzono, że wszystkie współczynniki odzysku mieściły się w zakresie 70%-200%.

Również różne warunki przechowywania nie miały wpływu na właściwości stymulujące wzrost próbek, jeśli były one przechowywane w temperaturze pokojowej przez okres do 18 godzin lub umieszczone w niskiej temperaturze przez okres do 6 godzin. Nieznacznie obniżony wskaźnik odzysku uzyskano dla próbek, które były wstępnie przechowywane dłużej niż 6 godzin w niskich temperaturach przed okresem inkubacji. Przechowywanie w temperaturze pokojowej po pobraniu próbki i przed oficjalną inkubacją wydaje się być preferowanym wyborem, ponieważ ta temperatura już wspiera wzrost różnych mikroorganizmów. Z drugiej strony, obecność pleśni może wiązać się z ryzykiem przerostu w przypadku przedłużonego przechowywania w temperaturze pokojowej.

Niewielka różnica między badaniem bezpośredniej inokulacji (część I) a badaniem in situ (część II) w celu przetestowania wstępnego przechowywania próbek przez 16-18 godzin w temperaturze 4-8 °C może być wyjaśniona różnym składem mikroflory in situ. Ponadto mikroorganizmy środowiskowe mogą zostać uszkodzone w wyniku wysuszenia. Konieczne będą dodatkowe badania w celu zweryfikowania tej różnicy.

Pobierz broszurę o monitorowaniu środowiska

Referencje

1. 2019. 2.6.12. Microbial examination of non-sterile products: Microbial Enumeration Tests. European Pharmacopoeia 9.8;

2. Grice E. A., Segre J. A. . 2011. The Skin Microbiome. Nature reviews Microbiology .(9):244-253.

3. Sandle T. 2011. A Review of Cleanroom Microflora: Types, Trends and Patterns. PDA J Pharm Sci and Tech. 65(4):

4. 2018. United States Pharmacopoeia 41 NF 36: . <61> Microbiological Examination of Non-Sterile Products: Microbial Enumeration Tests.