Montaż warstwa po warstwie (LbL) dla biomateriałów

Dr. Katsuhiko Ariga, Dr. Jonathan P. Hill

World Premier International (WPI) Research Center for Materials Nanoarchitectonics (MANA), National Institute for Materials Science (NIMS), Japan

Material Matters 2008, 3.3, 57.

ariga.katsuhiko@nims.go.jp

Wprowadzenie

Naukowcy poświęcają wiele czasu i wysiłku na rozwój funkcjonalnych materiałów i systemów. Z drugiej strony, natura potrzebowała wielu tysiącleci, aby wyewoluować wysoce funkcjonalne materiały, które można określić mianem biomateriałów. Być może ze względu na ogromną różnicę w czasie rozwoju, sztuczne materiały są często gorsze pod względem wydajności i specyfiki w porównaniu z biomateriałami. Dlatego też, z punktu widzenia racjonalnego projektowania materiałów, integracja funkcji biomateriałów z pożądanymi systemami powinna być korzystna. Niestety, biomateriały są podatne na osłabienie właściwości lub rozkład w trudnych warunkach chemicznych i fizycznych. Oczywiście biomateriały nie wyewoluowały w naturze do wykorzystania jako sztuczne komponenty urządzeń. Do skutecznego unieruchomienia biomateriałów w sztucznych strukturach konieczne jest łagodne, ale elastyczne podejście. Jedną z możliwych metod jest umieszczenie biomateriałów w cienkich błonach przypominających biomembrany, takich jak błony Langmuira-Blodgetta (LB) lub samoorganizujące się monowarstwy (SAM). Chociaż membrany te służą jako rozsądne media do funkcjonowania biomateriałów, błony te nie są ani proste w budowie, ani wszechstronne. Niedawno montaż warstwa po warstwie (LbL) pojawił się jako wszechstronna, delikatna i prosta metoda unieruchamiania funkcjonalnych cząsteczek w łatwo kontrolowanej morfologii cienkiej warstwy.^1,2 W tym krótkim przeglądzie przedstawiamy najnowsze postępy w systemach funkcjonalnych wytwarzanych przy użyciu łagodnej, ale adaptowalnej techniki LbL.

Zarys techniki LbL: dlaczego i jak łagodna dla biomateriałów?

Ogólny proces montażu LbL został zilustrowany na Rysunku 1a na przykładzie montażu między kationowymi polielektrolitami i anionowymi białkami. Osadzanie kationowego polielektrolitu na ujemnie naładowanej powierzchni stałego nośnika zwykle powoduje nadmierną adsorpcję, co skutkuje odwróceniem ładunku powierzchniowego. Późniejsza adsorpcja anionowych białek ponownie odwraca ładunek powierzchniowy, tak że zmiana ładunku powierzchniowego pozwala na ciągłe wytwarzanie struktury warstwowej. Ponieważ mechanizm ten może być stosowany do różnych naładowanych substancji, istnieje szeroki wybór dostępnych biomateriałów, w tym białek, kwasów nukleinowych, sacharydów i cząsteczek wirusów. Proces montażu, w wyniku którego powstają warstwy o nanometrowej grubości, może być przeprowadzony w roztworze wodnym w łagodnych warunkach otoczenia, przy użyciu jedynie zlewek i pęsety. Siła napędowa montażu LbL niekoniecznie ogranicza się do oddziaływań elektrostatycznych. Inne interakcje, takie jak wiązania wodorowe i koordynacja metali, mogą być wykorzystane do montażu.³ Interakcje biospecyficzne, na przykład rozpoznawanie między lektynami i cukrami, mogą zapewnić bardziej specyficzną konstrukcję folii.⁴

Kamieniem milowym w innowacji montażu LbL było wprowadzenie syntezy szablonów do tego procesu.⁵ Rysunek 1b ilustruje przygotowanie montażu LbL obejmujące cząstki koloidalne i późniejsze tworzenie pustych kapsułek. W tej strategii folie LbL są montowane sekwencyjnie, podobnie jak w przypadku konwencjonalnego montażu LbL, ale na koloidalnym rdzeniu. Zniszczenie centralnego rdzenia cząsteczki skutkuje powstaniem pustych kapsułek. Owijanie polielektrolitem poprzez montaż LbL na kryształach enzymu, a następnie rozpuszczanie kryształów enzymu, prowadzi do niezwykle wysokiego obciążenia enzymem w kapsułce o rozmiarze nano.⁶ Jeśli montaż LbL biomateriałów jest prowadzony we wnętrzu porowatego szablonu z tlenku glinu, późniejsze rozpuszczenie szablonu skutkuje utworzeniem mikrorurek złożonych z biomateriałów.⁷

Rysunek 1. Proces montażu LbL (a) na stałym podłożu; (b) na koloidalnym rdzeniu. Przedrukowano za zgodą z Ariga, K. et al. Phys. Chem. Chem. Phys. 2007, 9, 2319. © 2007, Royal Society of Chemistry.

Zastosowanie związane z bio: reaktory i czujniki

Szeroka swoboda dostępna w konstrukcji folii LbL może być korzystna dla przygotowania cienkowarstwowych reaktorów enzymatycznych zaprojektowanych dla określonych sekwencji reakcji.Rysunek 2 pokazuje jeden udany przykład reaktora dwuenzymowego zawierającego oksydazę glukozy i glukoamylazę przygotowanego na ultrafiltrze.⁸ Gdy substratowy roztwór skrobi został przepuszczony przez reaktor, hydroliza wiązania glukozowego skrobi przez glukoamylazę wytworzyła glukozę, która została następnie przekształcona w glukonolakton przez oksydazę glukozową z H₂O₂ jako produktem ubocznym. Wydajność reaktora można zoptymalizować, dostosowując liczbę warstw, sekwencję warstw i separację warstw.

Rysunek 2. Reaktor multienzymatyczny zmontowany w technologii LbL. Przedrukowano za zgodą Ariga, K. et al. Phys. Chem. Chem. Phys. 2007, 9, 2319. © 2007, Royal Society of Chemistry.

Wydajność reaktorów jednoenzymowych z oksydazą glukozy, przygotowanych metodą montażu LbL, w porównaniu z filmami LB zawierającymi ten sam enzym, wykazała znaczące zalety.⁹ Zwiększenie grubości w pierwszym przypadku nie zmieniło wydajności reakcji enzymatycznej, podczas gdy aktywność enzymu w grubszych filmach LB została drastycznie zmniejszona. Warstwy polielektrolitowe stosowane w montażu LbL wydają się być bardziej przepuszczalne dla prekursora reakcji niż skondensowana faza lipidowa w filmach LB. Trwałość, termostabilność i stabilność wobec zmian pH zostały również zbadane dla jednoskładnikowych filmów LbL. Reaktor LbL z oksydazą glukozy wykazał zwiększoną stabilność we wszystkich tych aspektach. Delikatne wiązanie cząsteczek enzymu w miękkiej poduszce polielektrolitowej może zapobiegać zmianom konformacyjnym nawet w przypadku zewnętrznych zaburzeń reaktora.

Zastosowania czujników są jednymi z najważniejszych potencjalnych zastosowań zespołów biomateriałów LbL. Metodę LbL można łatwo wykorzystać do wytwarzania cienkich warstw aktywnych struktur enzymatycznych na stałych powierzchniach elementów urządzeń czujnikowych, takich jak elektrody lub tranzystory. Na przykład Rusling i współpracownicy przeprowadzili pionierskie badania w tej dziedzinie, które opisali w niedawnym raporcie.¹⁰ Opracowali system wykrywania uszkodzeń DNA przy użyciu DNA i enzymu (mioglobiny lub cytochromu P450).¹¹ Enzym w folii generuje metabolit tlenek styrenu ze styrenu po aktywacji nadtlenkiem wodoru, a powstały tlenek styrenu reaguje z dwuniciowym DNA w tej samej folii. Proces ten można uznać za naśladujący metabolizm i uszkodzenia DNA w ludzkiej wątrobie. Do wykrywania uszkodzeń DNA wykorzystano woltamperometrię fali prostokątnej opartą na elektrochemii kompleksu Ru i kompleksu Co. Metodologia ta może znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach przesiewowych in vitro toksyczności organicznych prekursorów i metabolitów.

Zaawansowane zastosowania medyczne

Ponieważ technika LbL jest bardzo prosta i wszechstronna, wiele praktycznych zastosowań zostanie opracowanych w najbliższej przyszłości. Niektóre zastosowania biomedyczne w dostarczaniu leków i technologii komórkowej zostały już zrealizowane.

Opracowano wiele podejść do tworzenia struktur kapsułek przy użyciu metody LbL. Kapsułki mogą być stosowane jako nośniki do kontrolowanego dostarczania i uwalniania leków.¹² Na przykład, Lvov i współpracownicy opracowali unikalne podejście do enkapsulacji DNA we wnętrzu biokompatybilnej mikro-powłoki polielektrolitowej, z zachowaniem naturalnej struktury podwójnej helisy DNA (Rysunek 3).¹³ Degradacja DNA jest poważnym problemem w dostarczaniu genów. Sprawia to, że kluczowe znaczenie ma enkapsulacja DNA w odpowiednim nośniku, przygotowanym z materiałów przyjaznych dla środowiska. W opracowanej przez nich metodzie, cząsteczki MnCO₃ użyte jako materiał rdzenia matrycy, zostały zawieszone w roztworze DNA. Dodanie roztworu spermidyny do mieszanej mieszaniny MnCO₃/ DNA spowodowało wytrącenie nierozpuszczalnego w wodzie kompleksu DNA/spermidyna na cząstkach MnCO₃ . Mieszane rdzenie MnCO₃/DNA/spermidyna zostały następnie pokryte zespołem LbL składającym się z biokompatybilnej poliaargininy i siarczanu chondroityny. Późniejsze rozpuszczanie rdzenia przeprowadzono w dwóch etapach. Najpierw cząsteczki szablonu MnCO₃ rozpuszczono w deuterowanym 0,01 M HCl, w wyniku czego powstały biokompatybilne kapsułki zawierające kompleks DNA/spermidyna, a drugi etap obejmował dalsze traktowanie 0,1 M HCl, co spowodowało rozkład kompleksu DNA/spermidyna. Po drugim procesie spermidyna o niskiej masie cząsteczkowej została uwolniona do wnętrza kapsułki, pozostawiając biokompatybilną kapsułkę uwięzioną w DNA. Ponieważ przepuszczalność uwięzionych materiałów przez membrany polielektrolitowe może być regulowana przez czynniki zakłócające, takie jak zmiana pH, dodatkowy rozpuszczalnik i skok temperatury, możliwe jest kontrolowane uwalnianie uwięzionego DNA.

Rysunek 3. DNA uwięzione w kapsułce złożonej z LbL. Przedrukowano za zgodą Shchukin, D. G. et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3374. © 2004, American Chemical Society.

Zaproponowano również wykorzystanie planarnych warstw LbL w aplikacjach dostarczania leków. Na przykład Lynn i współpracownicy przygotowali folie LbL o grubości do 100 nm zawierające plazmidowe DNA, zakodowane dla wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego, z syntetycznym degradowalnym polimerem kationowym na powierzchniach płaskich podłoży krzemowych i kwarcowych.¹⁴ Po degradacji tego ostatniego polimeru plazmidowe DNA z folii LbL zostało uwolnione i stało się aktywne transkrypcyjnie, aby promować ekspresję wysokich poziomów wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego w komórce. Niedawno Yu, Ariga i współpracownicy opisali zawierające puste kapsułki folie LbL do kontrolowanego uwalniania materiałów.¹⁵ Przygotowane folie określane jako "mezoporowate nanokomórkowe folie" składały się z cząstek krzemionki i pustych kapsułek krzemionkowych (Rysunek 4). Powstałe w ten sposób mezoporowate nanokomórkowe błony posiadają specjalne możliwości enkapsulacji i uwalniania molekularnego, dzięki czemu uzyskano wolne od bodźców, automatycznie modulowane, stopniowe uwalnianie wody lub cząsteczek leku przez kanały mezoporowate wytrzymałych pojemników z kapsułkami krzemionkowymi osadzonymi w błonie. Zaobserwowano powtarzalne stopniowe uwalnianie uwięzionych cząsteczek, które wynika z nierównomiernego tempa parowania wody z kanałów mezoporów na zewnątrz i penetracji kapilarnej wody z wnętrza pojemnika do kanałów mezoporów. Te nanokomórkowe filmy są obiecującymi materiałami do dostarczania leków, ponieważ umożliwiają stopniowe uwalnianie środków terapeutycznych z prawdopodobną poprawą ich skuteczności.

Rysunek 4. Mezoporowata warstwa nanokomórkowa. Przedrukowano za zgodą Ji, Q. et al. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 2376. © 2008, American Chemical Society.

Aplikacje metody LbL w technologii komórkowej mają bardzo wymagające warunki wstępne. Kilka pionierskich prac badawczych z tym związanych zostało podsumowanych w niedawnym przeglądzie dokonanym przez Kotova i współpracowników.¹⁶ Na przykład, Jan i Kotov wykazali potencjalne zastosowanie folii LbL w technologii komórek macierzystych, gdzie badano różnicowanie wrażliwych na środowisko neuronalnych komórek macierzystych, zarówno jako neurosfery, jak i pojedyncze komórki, na foliach LbL z nanorurek węglowych i polielektrolitów.¹⁷ Benkirane-Jessel i współpracownicy wykazali kontrolę apoptozy komórkowej przez białko morfogenetyczne kości i jego antagonistę, Noggin, które zostały osadzone w warstwach LbL z poli-L-glutaminianu (P4761) i poli-L-lizyny (P9404).¹⁸ Jest to dobra demonstracja ilustrująca możliwość kontroli apoptozy in situ podczas różnicowania zębów, w której pośredniczą odczynniki osadzone w wielowarstwowej folii polielektrolitowej. De Smedt i współpracownicy przeprowadzili badania in vivo nad poborem komórkowym, degradacją i biokompatybilnością mikrokapsułek polielektrolitowych LbL, które zostały wytworzone z siarczanu dekstranu (D6924) i poli-L-argininy (P7762) warstw na szablonie mikrocząstek węglanu wapnia.¹⁹ Większość mikrokapsułek została zinternalizowana przez komórki i zaczęła ulegać degradacji w ciągu szesnastu dni po wstrzyknięciu podskórnym, co wskazuje, że mikrokapsułki LbL wykonane z degradowalnych polielektrolitów byłyby odpowiednie do dostarczania leków.

Perspektywy na przyszłość

W tym krótkim przeglądzie pokrótce przedstawiliśmy kilka aspektów metody LbL z wykorzystaniem biomateriałów. Jej łagodność jest jedną z jej najbardziej wyraźnych cech i sprawia, że metoda ta ma zastosowanie do delikatnych biomateriałów. Inne jej cechy, takie jak prostota i wszechstronność, są ważne dla wykonywania delikatnych procedur wytwarzania. Metodę LbL można łączyć z istniejącymi odgórnymi strategiami mikrofabrykacji i nanofabrykacji.²⁰ Prostota metody montażu LbL sprawia, że jest ona kompatybilna z technikami mikrofabrykacji, takimi jak fotolitografia, litografia atramentowa i inne techniki wzornictwa w celu dostosowania do szerokiego zakresu celów. Połączenie metody LbL z odgórnymi metodami wytwarzania doprowadzi do integracji biomateriałów ze strukturami mikrofabrykowanymi i zaowocuje następną generacją bio-nanourządzeń i ultradrobnych biourządzeń, na przykład mikromacierzy biosensorów i reaktorów mikro-końcówek.

Referencje

1. Decher G. 1997. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. 277(5330):1232-1237. https://doi.org/10.1126/science.277.5330.1232

2. Ariga K, Hill JP, Ji Q. 2007. Layer-by-layer assembly as a versatile bottom-up nanofabrication technique for exploratory research and realistic application. Phys. Chem. Chem. Phys.. 9(19):2319. https://doi.org/10.1039/b700410a

3. Quinn JF, Johnston APR, Such GK, Zelikin AN, Caruso F. 2007. Next generation, sequentially assembled ultrathin films: beyond electrostatics. Chem. Soc. Rev.. 36(5):707. https://doi.org/10.1039/b610778h

4. Lvov Y, Ariga K, Ichinose I, Kunitake T. 1995. Layer-by-layer architectures of concanavalin A by means of electrostatic and biospecific interactions. J. Chem. Soc., Chem. Commun..(22):2313. https://doi.org/10.1039/c39950002313

5. Wang Y, Angelatos AS, Caruso F. 2008. Template Synthesis of Nanostructured Materials via Layer-by-Layer Assembly?. Chem. Mater.. 20(3):848-858. https://doi.org/10.1021/cm7024813

6. Caruso F, Trau D, Möhwald H, Renneberg R. 2000. Enzyme Encapsulation in Layer-by-Layer Engineered Polymer Multilayer Capsules. Langmuir. 16(4):1485-1488. https://doi.org/10.1021/la991161n

7. Lu G, Ai S, Li J. 2005. Layer-by-Layer Assembly of Human Serum Albumin and Phospholipid Nanotubes Based on a Template. Langmuir. 21(5):1679-1682. https://doi.org/10.1021/la047771r

8. Onda M, Lvov Y, Ariga K, Kunitake T. 1996. Sequential reaction and product separation on molecular films of glucoamylase and glucose oxidase assembled on an ultrafilter. Journal of Fermentation and Bioengineering. 82(5):502-506. https://doi.org/10.1016/s0922-338x(97)86992-9

9. Onda M, Ariga K, Kunitake T. 1999. Activity and stability of glucose oxidase in molecular films assembled alternately with polyions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 87(1):69-75. https://doi.org/10.1016/s1389-1723(99)80010-3

10. Rusling JF, Hvastkovs EG, Hull DO, Schenkman JB. Biochemical applications of ultrathin films of enzymes, polyions and DNA. Chem. Commun..(2):141-154. https://doi.org/10.1039/b709121b

11. Zhou L, Yang J, Estavillo C, Stuart JD, Schenkman JB, Rusling JF. 2003. Toxicity Screening by Electrochemical Detection of DNA Damage by Metabolites Generated In Situ in Ultrathin DNA?Enzyme Films. J. Am. Chem. Soc.. 125(5):1431-1436. https://doi.org/10.1021/ja0290274

12. De Geest BG, Sanders NN, Sukhorukov GB, Demeester J, De Smedt SC. Release mechanisms for polyelectrolyte capsules. Chem. Soc. Rev.. 36(4):636-649. https://doi.org/10.1039/b600460c

13. Shchukin DG, Patel AA, Sukhorukov GB, Lvov YM. 2004. Nanoassembly of Biodegradable Microcapsules for DNA Encasing. J. Am. Chem. Soc.. 126(11):3374-3375. https://doi.org/10.1021/ja036952x

14. Zhang J, Chua LS, Lynn DM. 2004. Multilayered Thin Films that Sustain the Release of Functional DNA under Physiological Conditions. Langmuir. 20(19):8015-8021. https://doi.org/10.1021/la048888i

15. Ji Q, Miyahara M, Hill JP, Acharya S, Vinu A, Yoon SB, Yu J, Sakamoto K, Ariga K. 2008. Stimuli-Free Auto-Modulated Material Release from Mesoporous Nanocompartment Films. J. Am. Chem. Soc.. 130(8):2376-2377. https://doi.org/10.1021/ja076139s

16. Tang Z, Wang Y, Podsiadlo P, Kotov N. 2006. Biomedical Applications of Layer-by-Layer Assembly: From Biomimetics to Tissue Engineering. Adv. Mater.. 18(24):3203-3224. https://doi.org/10.1002/adma.200600113

17. Jan E, Kotov NA. 2007. Successful Differentiation of Mouse Neural Stem Cells on Layer-by-Layer Assembled Single-Walled Carbon Nanotube Composite. Nano Lett.. 7(5):1123-1128. https://doi.org/10.1021/nl0620132

18. Nadiri A, Kuchler-Bopp S, Mjahed H, Hu B, Haikel Y, Schaaf P, Voegel J, Benkirane-Jessel N. 2007. Cell Apoptosis Control Using BMP4 and Noggin Embedded in a Polyelectrolyte Multilayer Film. Small. 3(9):1577-1583. https://doi.org/10.1002/smll.200700115

19. De?Koker S, De?Geest B, Cuvelier C, Ferdinande L, Deckers W, Hennink W, De?Smedt S, Mertens N. 2007. In vivo Cellular Uptake, Degradation, and Biocompatibility of Polyelectrolyte Microcapsules. Adv. Funct. Mater.. 17(18):3754-3763. https://doi.org/10.1002/adfm.200700416

20. Hammond P. 2004. Form and Function in Multilayer Assembly: New Applications at the Nanoscale. Adv. Mater.. 16(15):1271-1293. https://doi.org/10.1002/adma.200400760