Fluorescencyjne cząstki nanodiamentów: Właściwości i zastosowania

Dr. Olga A. Shenderova

President, Adámas Nanotechnologies, Inc.

Wprowadzenie

Cząstki nanodiamentu (ND) są coraz częściej wykorzystywane jako środki diagnostyczne, obrazujące i terapeutyczne w biomedycynie,¹ do kryptografii i obliczeń kwantowych w kwantowym przetwarzaniu informacji oraz jako czujniki jednospinowe w nanomagnetometrii.^2,3 Większość z tych zastosowań opiera się na unikalnych właściwościach optycznych i magnetycznych związanych z defektami punktowymi w diamencie. Ze względu na obecność szerokiego pasma wzbronionego, NS często zawierają defekty atomowe lub zanieczyszczenia, z których niektóre są silnie luminescencyjne, co czyni je użytecznymi jako fluorescencyjne, katodoluminescencyjne lub fotoakustyczne środki obrazujące.¹ ND są wysoce biokompatybilne i mają z natury niską cytotoksyczność i genotoksyczność.¹

Czytaj więcej o

• Właściwości optyczne fluorescencyjnego nanodiamentu (FND)
• chemia powierzchni nanodiamentów
• Zastosowania
• Referencje

Właściwości optyczne fluorescencyjnego nanodiamentu (FND)

Atrogen jest najczęstszym zanieczyszczeniem w diamencie, włączonym do sieci krystalicznej jako izolowane substytucyjne atomy azotu lub dwa najbliższe sąsiednie substytucyjne atomy azotu, wśród innych licznych defektów zawierających N. Pustki uwięzione przez atomy azotu tworzą różne centra kolorów, w zależności od rodzaju stanu N w diamencie. Defekt pustki azotowej (N-V), odpowiedzialny za czerwoną / bliską podczerwieni fluorescencję diamentu, oraz centra barwne pustki azotowej i azotu (N-V-N) (lub centra H3), z jasnozieloną fotoluminescencją, są optycznie aktywnymi defektami, które otrzymały najwięcej uwagi (Rysunek 1).^1-3 Centrum N-V jest defektem utworzonym w diamencie przez jeden substytucyjny atom azotu i sąsiedni wakans, podczas gdy centrum N-V-N składa się z kompleksu azot-pustka-azot (Rysunek 2). Wakanse mogą być wytwarzane przez napromieniowanie ND cząstkami o wysokiej energii. Późniejsze wygrzewanie w wysokiej temperaturze powoduje dyfuzję wakansów i tworzenie centrów barwnych z atomami azotu.

Rysunek 1. Fluorescencja diamentu opiera się na centrach kolorów wbudowanych w sieć diamentową: centra wakancji azotu (N-V) zapewniają czerwoną fluorescencję (po lewej), a N-V-N (lub centrum H3) emitują zielone światło (po prawej).

Rysunek 2. Fotoluminescencyjne widma emisyjne 100nm cząstek ND zawierających centra N-V (a) i N-V-N (b) zdyspergowanych w wodzie DI o stężeniu 1mg/mL. Długość fali wzbudzenia wynosi odpowiednio 532nm i 442nm. Pik przy 488nm (b) odpowiada przesunięciu ramanowskiemu diamentu.

Właściwości optyczne centrum N-V są dobrze dostosowane do zastosowań bioobrazowania, ze wzbudzeniem optycznym od 490-560 nm i emisją w czerwonej \ bliskiej podczerwieni (637-800 nm) (Rysunek 2a), z dala od większości autofluorescencyjnych składników komórek. Emisja występuje w oknie spektralnym o niskiej absorpcji, atrakcyjnym dla znakowania biologicznego ze względu na większą penetrację światła w otaczającej tkance. Widma centrów N-V wykazują linię zero-fononową (ZPL) przy 638 nm dla ujemnie naładowanego defektu (N-V^-) i ZPL przy 575 nm dla stanu neutralnego (Rysunek 2a). Intensywność luminescencji z ND zawierających centra NV zależy od liczby centrów N-V w cząsteczce. Na przykład, cząstki ND o wielkości 100 nm mogą mieć jasność PL przekraczającą jasność barwnika Atto 532 o więcej niż rząd wielkości, gdy są porównywane obok siebie w identycznych warunkach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Centrum H3 emituje zieloną fluorescencję z maksimum około 530 nm (Rysunek 2b) po wzbudzeniu światłem niebieskim. Niezwykłą cechą centrów N-V i N-V-N jest to, że nie fotobleją ani nie mrugają nawet w warunkach ciągłego wzbudzenia o wysokiej energii⁴ co czyni je lepszymi od konwencjonalnych chromoforów ze względu na ich niespotykaną fotostabilność.

Naładowane ujemnie centrum NV w cząsteczkach ND pojawiło się również jako ważny system do wykrywania kwantowego.^2,3 Ponieważ stan spinowy centrum N-V^- może być wykrywany optycznie w połączeniu z protokołem rezonansu magnetycznego przy użyciu optycznie wykrywanego rezonansu magnetycznego (ODMR), a stan spinu jest wrażliwy na otaczające pole magnetyczne, cząsteczka ND zawierająca pojedynczy N-V^- może być wykorzystywana jako ultraczuły magnetometr pracujący w warunkach otoczenia. Oprócz pól magnetycznych, centra N-V^- wykazują wysoką czułość na pola elektryczne, temperaturę i odkształcenia.^2,3

Nanodiamond Surface Chemistry

Ponieważ centra barwne są osadzone w matrycy diamentowej, modyfikacja powierzchni nie wpływa na ich właściwości fluorescencyjne.¹ Chociaż powierzchnia diamentu luzem została uznana za chemicznie obojętną, ND zazwyczaj zawierają liczne powierzchniowe grupy funkcyjne zawierające tlen (tj, -COOH, -OH, karbonyle, estry itp.), które są wprowadzane podczas oczyszczania przy użyciu silnych utleniaczy lub generowane w reakcji redukcji (na przykład przy użyciu wodorku litowo-glinowego, LiAlH4).⁵ ND można również oczyszczać za pomocą trawienia sp² węgla wodorem. Łatwa funkcjonalizacja powierzchni została osiągnięta metodami chemicznymi, fotochemicznymi, mechanochemicznymi, enzymatycznymi, plazmowymi i laserowymi.⁵ Zastosowanie silnej obróbki chemicznej lub ekstremalnych temperatur (tj, autoklawowanie do sterylizacji lub ciekły azot do przechowywania) sprawia, że ND nadają się do użytku medycznego bez degradacji struktury krystalicznej (sp³ wiązania) rdzenia. Dzięki wielu metodom funkcjonalizacji powierzchni, ND mogą być łatwo włączane do innych matryc przydatnych do wiązania jednostek biologicznych, takich jak białka, enzymy, hormony, antygeny, DNA lub leki, zarówno poprzez interakcje elektrostatyczne, jak i kowalencyjne.⁶ Na przykład, enkapsulacja fluorescencyjnych ND w warstwie lipidowej zwiększa dyfuzję cząstek w cytoplazmie o więcej niż jeden rząd wielkości.⁷ Powierzchnia ND jest podatna na derywatyzację różnymi organicznymi grupami funkcyjnymi w celu późniejszego połączenia z bioaktywnymi cząsteczkami, co czyni ją odpowiednią do zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych. Wysoką specyficzność FND w różnych testach komórkowych wykazano dla FND kowalencyjnie sprzężonych ze streptawidyną, do której przyłączono przeciwciała znakowane biotyną.⁸ Aby uniknąć niespecyficznego znakowania, zaleca się stosowanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) jako środka stabilizującego, zapewniającego wysoką odporność nanocząstek diamentowych pokrytych BSA na flokulację w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej.⁹

Applications

Pierwsze doniesienia o zastosowaniu FNDs do znakowania biologicznego in vitro pojawiły się w 2005 roku,znakowanie biologiczne in vitro. pojawiło się w 2005 roku,¹⁰ wykazując, że FND zawierające centra N-V mogą być spontanicznie internalizowane przez komórki i mają bardzo niską toksyczność. Jasność i stabilność fluorescencji tych diamentów sprawiły, że są one odpowiednie do śledzenia pojedynczych cząstek w komórkach.⁴ Stabilna fluorescencja diamentu umożliwia długoterminowe śledzenie optyczne i wykrywanie w nanoskali. Lepszy kontrast obrazu ND w komórkach można również osiągnąć poprzez detekcję czasową fluorescencji centrum N-V¹¹ wykorzystując długotrwały czas życia fluorescencji, do ~20 ns, ND, który jest znacznie dłuższy niż czas życia, ~3 ns, dla autofluorescencji komórek i tkanek.

Doskonała fotostabilność FND umożliwiła obrazowanie w super rozdzielczości poprzez stymulowane zubożenie emisji (STED).⁹   Trójwymiarowe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości można łatwo uzyskać w czasie rzeczywistym.  Za pomocą mikroskopii STED pojedyncze cząstki FND (~ 30 nm) zostały rozróżnione w komórkach z rozdzielczością subdyfrakcyjną około 40 nm.⁹

Obrazowanie ze wzbudzeniem wielofotonowym jest potężnym narzędziem, które umożliwia obrazowanie tkanek w żywych organizmach z większą głębokością penetracji.Dodatkowo mikroskopia zapewnia lepszy kontrast obrazu i mniejsze fotouszkodzenia komórek.  Obecność pojedynczych cząstek FND (~40 nm) w komórkach wykryto za pomocą femtosekundowego lasera podczerwonego.⁷

Właściwość spinowa centrów N-V^- optycznie wykrywany rezonans magnetyczny, została wykorzystana do poprawy kontrastu obrazu FND.nbsp;in vitro i in vivo i przezwyciężenia problemu autofluorescencji spowodowanej przez endogenne cząsteczki.^12,13 W szerokopolowym obrazowaniu fluorescencyjnym in vivo naprzemienne promieniowanie mikrofalowe modulowało jedynie intensywność fluorescencji centrum N-V^- podczas gdy fluorescencja tła pozostawała stała. Przetwarzanie obrazu skutecznie usunęło sygnały autofluorescencji tła i znacznie poprawiło kontrast obrazu.¹² W alternatywnym podejściu modulowane pole magnetyczne zostało wykorzystane do uzyskania pozbawionego tła obrazowania szerokopasmowego centrów N-V^- w ND zlokalizowanych w wartowniczym węźle chłonnym.¹⁴ Kontrast obrazu został poprawiony o prawie dwa rzędy wielkości. Niektóre centra barwne w ND posiadają katodoluminescencję i pozostają stabilne podczas długotrwałej ekspozycji na wiązkę elektronów, zapewniając cenne etykiety do bioobrazowania opartego na korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM). Kolorowe obrazy zielonych i czerwonych FND w żywych komórkach HeLa uzyskano za pomocą mikroskopu CLEM¹⁵ ujawniając szczegóły strukturalne z doskonałą rozdzielczością przestrzenną w żywych systemach biologicznych. Podsumowując, ND zawierające centra barwne posiadają jasną fluorescencję bez fotowybielania i migania, co w połączeniu z ich biokompatybilnością i łatwą biofunkcjonalizacją sprawia, że ND są idealnymi bioprobami do obrazowania molekularnego i znakowania komórek. Unikalna kombinacja właściwości spinowych i fotoluminescencyjnych niektórych typów centrów barwnych w ND otwiera nowe perspektywy w odkrywaniu nowych metod bioobrazowania i wykrywania opartych na centrach barwnych ND.

Referencje

1. Vaijayanthimala V, Lee DK, Kim SV, Yen A, Tsai N, Ho D, Chang H, Shenderova O. 2015. Nanodiamond-mediated drug delivery and imaging: challenges and opportunities. Expert Opinion on Drug Delivery. 12(5):735-749. https://doi.org/10.1517/17425247.2015.992412

2. Schirhagl R, Chang K, Loretz M, Degen CL. 2014. Nitrogen-Vacancy Centers in Diamond: Nanoscale Sensors for Physics and Biology. Annu. Rev. Phys. Chem.. 65(1):83-105. https://doi.org/10.1146/annurev-physchem-040513-103659

3. Doherty MW, Manson NB, Delaney P, Jelezko F, Wrachtrup J, Hollenberg LC. 2013. The nitrogen-vacancy colour centre in diamond. Physics Reports. 528(1):1-45. https://doi.org/10.1016/j.physrep.2013.02.001

4. Chang Y, Lee H, Chen K, Chang C, Tsai D, Fu C, Lim T, Tzeng Y, Fang C, Han C, et al. 2008. Mass production and dynamic imaging of fluorescent nanodiamonds. Nature Nanotech. 3(5):284-288. https://doi.org/10.1038/nnano.2008.99

5. Mochalin VN, Shenderova O, Ho D, Gogotsi Y. 2012. The properties and applications of nanodiamonds. Nature Nanotech. 7(1):11-23. https://doi.org/10.1038/nnano.2011.209

6. Krueger A, Lang D. 2012. Functionality is Key: Recent Progress in the Surface Modification of Nanodiamond. Adv. Funct. Mater.. 22(5):890-906. https://doi.org/10.1002/adfm.201102670

7. Hui YY, Zhang B, Chang Y, Chang C, Chang H, Hsu J, Chang K, Chang F. 2010. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy of lipid-encapsulated fluorescent nanodiamonds in living cells. Opt. Express. 18(6):5896. https://doi.org/10.1364/oe.18.005896

8. Chang B, Lin H, Su L, Lin W, Lin R, Tzeng Y, Lee RT, Lee YC, Yu AL, Chang H. 2013. Highly Fluorescent Nanodiamonds Protein-Functionalized for Cell Labeling and Targeting. Adv. Funct. Mater.. 23(46):5737-5745. https://doi.org/10.1002/adfm.201301075

9. Tzeng Y, Faklaris O, Chang B, Kuo Y, Hsu J, Chang H. 2011. Superresolution Imaging of Albumin-Conjugated Fluorescent Nanodiamonds in Cells by Stimulated Emission Depletion. Angew. Chem. Int. Ed.. 50(10):2262-2265. https://doi.org/10.1002/anie.201007215

10. Yu S, Kang M, Chang H, Chen K, Yu Y. 2005. Bright Fluorescent Nanodiamonds:  No Photobleaching and Low Cytotoxicity. J. Am. Chem. Soc.. 127(50):17604-17605. https://doi.org/10.1021/ja0567081

11. Kuo Y, Hsu T, Wu Y, Hsu J, Chang H. 2013. Fluorescence lifetime imaging microscopy of nanodiamonds in vivo. https://doi.org/10.1117/12.2004494

12. Igarashi R, Yoshinari Y, Yokota H, Sugi T, Sugihara F, Ikeda K, Sumiya H, Tsuji S, Mori I, Tochio H, et al. 2012. Real-Time Background-Free Selective Imaging of Fluorescent Nanodiamonds in Vivo. Nano Lett.. 12(11):5726-5732. https://doi.org/10.1021/nl302979d

13. Hegyi A, Yablonovitch E. 2013. Molecular Imaging by Optically Detected Electron Spin Resonance of Nitrogen-Vacancies in Nanodiamonds. Nano Lett.. 13(3):1173-1178. https://doi.org/10.1021/nl304570b

14. Sarkar SK, Bumb A, Wu X, Sochacki KA, Kellman P, Brechbiel MW, Neuman KC. 2014. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed. Opt. Express. 5(4):1190. https://doi.org/10.1364/boe.5.001190

15. Nawa Y, Inami W, Lin S, Kawata Y, Terakawa S, Fang C, Chang H. 2014. Multi-Color Imaging of Fluorescent Nanodiamonds in Living HeLa Cells Using Direct Electron-Beam Excitation. ChemPhysChem. 15(4):721-726. https://doi.org/10.1002/cphc.201300802