RT-qPCR - ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją

RT-qPCR, czyli ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją, łączy efekty odwrotnej transkrypcji i ilościowego PCR lub PCR w czasie rzeczywistym w celu amplifikacji i wykrywania określonych celów. RT-qPCR ma wiele zastosowań, w tym ilościowe określanie poziomów ekspresji genów, walidację interferencji RNA (RNAi) i wykrywanie patogenów, takich jak wirusy. Powszechne podejścia do generowania sygnału fluorescencyjnego wykorzystywanego do pomiaru ilości DNA w tej technice polegają na użyciu sond hydrolizujących, takich jak sondy TaqMan^® lub dwuniciowego barwnika wiążącego DNA, takiego jak barwnik SYBR^® Green.

Co to jest RT-qPCR?

Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) obejmuje wykrywanie i kwantyfikację RNA. Proces ten odbywa się poprzez odwrotną transkrypcję całkowitego RNA lub mRNA do komplementarnego DNA (cDNA) za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy, a następnie amplifikację i wykrywanie określonych celów tego cDNA przy użyciu techniki zwanej ilościowym PCR (qPCR) lub PCR w czasie rzeczywistym. W każdym cyklu podczas tego PCR ilość DNA jest mierzona w czasie rzeczywistym przy użyciu różnych chemikaliów fluorescencyjnych. Najpopularniejszymi metodami generowania sygnału fluorescencyjnego jest użycie sond hydrolizujących, takich jak sondy TaqMan^® lub dwuniciowego barwnika wiążącego DNA, takiego jak barwnik SYBR^® Green.

Wybór chemii fluorescencyjnej zależy od takich czynników, jak zastosowanie, koszt i to, czy test jest testem typu singleplex czy multipleks. Barwniki wiążące DNA są preferowane w przypadku testów typu singleplex o niskiej przepustowości, ponieważ są łatwiejsze do zaprojektowania, mają krótszy czas konfiguracji i są bardziej opłacalne. Sondy fluorescencyjne są częściej stosowane w wysokoprzepustowych testach multipleksowych, które wymagają wyższej specyficzności.

Aby uzyskać więcej informacji na temat qPCR, zobacz nasze Przewodnik techniczny ilościowego PCR

Zastosowania RT-qPCR

RT-qPCR ma wiele zastosowań. Technika RT-qPCR jest wykorzystywana do:

• kwantyfikacji poziomów ekspresji genów
• walidacji RNAi w celu badania utraty funkcji selektywnych genów
• wykrywania patogenów, takich jak wirusy, w celu diagnozowania chorób zakaźnych
• wykrywanie organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO)

Jednoetapowy RT-qPCR vs Dwuetapowy RT-qPCR

RT-qPCR jest wykonywany w teście jednoetapowym lub dwuetapowym. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę różne czynniki, takie jak koszt, zastosowanie i rodzaj testu przy wyborze odpowiedniego rodzaju metody RT-qPCR.

Rysunek 1. Schemat porównujący jednoetapowy przepływ pracy RT-qPCR z dwuetapowym przepływem pracy RT-qPCR.

Jednostopniowy RT-qPCR

W jednostopniowym RT-qPCR, odwrotna transkrypcja lub synteza cDNA i qPCR są przeprowadzane w jednej probówce przy użyciu starterów specyficznych dla sekwencji w celu amplifikacji określonego celu. Genetycznie zmodyfikowane odwrotne transkryptazy są powszechnie stosowane w testach jednoetapowych, ponieważ tolerują wyższe temperatury niezbędne do wyżarzania starterów specyficznych dla sekwencji. Test jednoetapowy jest preferowany, gdy przeprowadzana jest wielokrotna kwantyfikacja tego samego genu, szczególnie w zastosowaniach o wysokiej wydajności i diagnostycznych. Innym czynnikiem branym pod uwagę przy wyborze testów jednoetapowych jest jakość i niedobór RNA. Ponieważ cDNA zsyntetyzowanego podczas reakcji nie można zapisać oddzielnie jako alikwot, do powtórzenia testu może być wymagane więcej próbek oryginalnego RNA.

Dwuetapowy RT-qPCR

W dwuetapowym RT-qPCR reakcje odwrotnej transkrypcji i qPCR są przeprowadzane w oddzielnych probówkach z oddzielnymi buforami i odczynnikami. W testach dwuetapowych można stosować losowe heksamery, startery oligo-dT i/lub startery specyficzne dla genów. Posiadanie oddzielnych buforów i odczynników pozwala na większą elastyczność w wyborze enzymów odwrotnej transkryptazy i odczynników PCR, z większą liczbą opcji optymalizacji i poprawy wydajności amplifikacji trudnych szablonów. Bardziej stabilny cDNA, który jest syntetyzowany w pierwszym etapie, może być dalej zatężany i/lub oczyszczany w celu przechowywania do przyszłego użytku lub może być używany do ilościowego oznaczania wielu genów z tej samej próbki.

Tabela 1. Kluczowe cechy i startery stosowane w jedno- i dwuetapowych testach RT-qPCR.

Typ testu	Użyte startery	Kluczowe cechy
One-Step RT-qPCR	Sequence-specific primers	Zmniejszona zmienność eksperymentalna Łatwa obsługa z niskim ryzykiem zanieczyszczenia Szybszy protokół z mniejszą liczbą kroków Łatwa automatyzacja Zwiększona specyficzność Idealny dla aplikacji o wysokiej wydajności
Dwuetapowa RT-qPCR	Startery oligo (dT), losowe heksamery i/lub startery specyficzne dla sekwencji	Flexibility to optimize RT and PCR reactions separately Umożliwia wielokrotne reakcje PCR z pojedynczej próbki RNA/RT bez multipleksowania Większy wybór starterów RT Stabilne cDNA może być przechowywane do wykorzystania w przyszłości

Dowiedz się więcej na temat optymalizacji testów PCR w naszym  Strona optymalizacji i walidacji testów

Jednoetapowe produkty RT-qPCR do zastosowań wysokoprzepustowych

.Nasze jednoetapowe produkty RT-qPCR łączą działanie odwrotnej transkryptazy z przeciwciałem kierowanym przez Taq w wygodnych mieszaninach reakcyjnych ReadyMixTM PCR do zastosowań opartych na sondach lub SYBR^® Green. Niezależnie od trudnych struktur drugorzędowych lub chemii wykrywania, nasze mieszaniny reakcyjne ReadyMixTM PCR są specjalnie opracowane, aby pomóc osiągnąć doskonałe wyniki w mniejszej liczbie kroków.

Nasze produkty z łatwością wpasują się w Twój przepływ pracy PCR, a dzięki różnorodności niezawodnych produktów do jednoetapowych eksperymentów RT-qPCR - nie dokonasz złego wyboru. Odkryj KiCqStart^® produkty i znajdź mieszankę wzorcową ReadyMix™ zoptymalizowaną dla Twojego urządzenia lub poznaj nasze opcje JumpStart™ dla zestawów zoptymalizowanych pod kątem potrzeb eksperymentalnych. Do wysokowydajnej, szybkiej, jednoetapowej kwantyfikacji RNA przy użyciu specyficznych dla sekwencji sond fluorogenicznych wybierz uniwersalny zestaw KAPA PROBE FAST. Wybierz dowolny z naszych produktów RT-qPCR bez kompromisów w zakresie jakości.

One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ KiCqStart^®. -  Kompatybilny ze wszystkimi głównymi urządzeniami qPCR

Nasz KiCqStart^® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ charakteryzują się rygorystycznym mechanizmem gorącego startu dla większej specyficzności i są opracowane tak, aby były wysoce tolerancyjne na inhibitory PCR w próbkach. Te wysoce czułe, gotowe do użycia mieszanki wzorcowe zostały zaprojektowane z myślą o wygodzie i zawierają wszystkie wymagane podstawowe składniki do qPCR lub RT-qPCR. Wystarczy dodać startery, sondę i wodę, aby uzupełnić koktajl testowy. Ten produkt jest idealny do szybkiego lub konwencjonalnego qPC

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
KCQS07	KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™	For Bio-Rad®, Cepheid®, Eppendorf®, Illumina®, Corbett® i Roche® Instruments
KCQS08	KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, Low ROX™	For Applied Biosystems® (ABI) i Stratagene® instruments
KCQS09	KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ROX	Dla urządzeń Applied Biosystems® (ABI)

Dowiedz się więcej o kompatybilności urządzeń z tymi produktami w naszym  Pełna karta kompatybilności urządzeń lub odkryj nasze Niestandardowe sondy qPCR.

JumpStart™ Taq ReadyMix™ - Zoptymalizowany dla wszystkich głównych instrumentów qPCR

Nasz JumpStart™ Taq ReadyMix™ do RT-qPCR łączy w sobie zalety odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV RT) i naszej JumpStart™ polimerazy Taq inaktywowanej przeciwciałem. Solidna M-MLV RT ma zdolność transkrypcji przez trudne struktury drugorzędowe, nawet w podwyższonych temperaturach, podczas gdy nasza polimeraza JumpStart™ Taq zapewnia większą specyficzność i czułość niż standardowa polimeraza Taq. Produkty te są kompatybilne zarówno z aparatami probówkowymi i płytkowymi, jak i kapilarnymi.

Zaoszczędź 20% na RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200), używając kodu SGX przy kasie. Ważny do 31 stycznia 2021 r.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
.QR0100	SYBR® Green RT-qPCR	Wysoka specyficzność, niskie ryzyko kontaminacji, łatwa odtwarzalność
QR0200	RT-qPCR ReadyMix™ dla aplikacji opartych na sondach	Wysoka specyficzność, niskie ryzyko kontaminacji, łatwa odtwarzalność

KAPA PROBE FAST - Kompatybilny ze wszystkimi technologiami opartymi na sondach fluorogenicznych

Zestaw KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix Universal Kit to czułe i wygodne rozwiązanie do PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem RNA jako matrycy. Zestaw został zaprojektowany do wysokowydajnej, szybkiej, jednoetapowej kwantyfikacji RNA przy użyciu sond fluorogenicznych specyficznych dla sekwencji. Jest kompatybilny ze wszystkimi technologiami opartymi na sondach fluorogenicznych, w tym sondami hybrydyzacyjnymi (np. sondami FRET), sondami hydrolizy (np. sondami TaqMan^® ) i sondami wypierającymi (np. sondami molekularnymi),

Zestaw ten jest gotowym do użycia koktajlem zawierającym wszystkie składniki z wyjątkiem starterów, sond i matrycy do szybkiej cyklicznej reakcji PCR w czasie rzeczywistym opartej na sondach. Zestaw zawiera KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix, barwniki referencyjne ROX High i ROX Low, KAPA RT Mix i dUTP.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
KK4752	KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) Universal Kit	Wysokowydajna, szybka, jednoetapowa kwantyfikacja RNA przy użyciu specyficznych dla sekwencji sond fluorogenicznych

ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit - Kompatybilny ze wszystkimi głównymi instrumentami qPCR

Odwrotna transkryptaza ABScript II w zestawie zapewnia niezawodną odwrotną transkrypcję RNA. Po odwrotnej transkrypcji, polimeraza Taq w wersji hot-start jest aktywowana w temperaturze 95 °C, a odwrotna transkryptaza ABScript II jest jednocześnie inaktywowana. W sekwencyjnej reakcji PCR aktywność egzonukleazy 5′-3′ polimerazy Taq rozszczepia zhybrydyzowaną sondę, oddzielając reporter od wygaszacza i uwalniając sygnał fluorescencyjny.

Zestaw ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit jest gotowym do użycia zestawem do odwrotnej transkrypcji i późniejszego qPCR opartego na sondzie w jednej probówce. Elastyczny format tego zestawu obejmuje dwa oddzielne 50-krotne stężenia barwnika ROX (pasywne odniesienie), które należy dodać zgodnie z wymaganiami określonych instrumentów qPCR.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
RK20407	ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit	Analizuje próbki RNA o niskim poziomie wejściowym, niskie ryzyko kontaminacji

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Dwuetapowe produkty RT-qPCR dla większej elastyczności

Oferujemy wszystkie odczynniki potrzebne do przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji, a następnie analizy PCR zsyntetyzowanego cDNA w oddzielnych probówkach dla większej elastyczności w eksperymentach. Bez obaw włącz nasze dwuetapowe produkty RT-qPCR do przepływu pracy PCR bez uszczerbku dla elastyczności. Dzięki różnym opcjom dostępnym dla naszych niezawodnych produktów PCR, nie dokonasz złego wyboru.

Zestawy i mieszanki do syntezy cDNA

Aby zaspokoić swoje potrzeby w zakresie odwrotnej transkrypcji, wybierz spośród różnych typów enzymów i kilku opcji pakowania. Wszystkie te produkty zawierają odczynniki niezbędne do syntezy pierwszej nici i są dostępne jako zestawy z oddzielnymi odczynnikami do optymalizacji lub jako kompletne mieszanki do szybkiej i wygodnej syntezy pierwszej nici.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
STR1	Enhanced Avian First-Strand Synthesis Kit	Wysoko oczyszczony eAMV-RT - transkrybuje trudną strukturę drugorzędową w wysokiej temperaturze Wykrywa mRNA o niskiej liczebności
11483188001	Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA do RT-PCR	Zawiera AMV RT zapewniający wyższą termostabilność w porównaniu do M-MuLV RT Zawiera inhibitor RNazy i mieszankę dNTP do PCR
RDRT	ReadyScript™ cDNA Synthesis Mix	Czułe i łatwe w użyciu rozwiązanie do dwuetapowej reakcji RT-PCR ReadyScript™ Enzym jest zmodyfikowanym przez RNazę H (+) M-MuLV RT
11117831001	Zestaw do syntezy cDNA	Zoptymalizowana procedura jednorurowa do syntezy dwuniciowego cDNA do 3 kb z całkowitego RNA lub mRNA
THIFICDNARO	Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit	Zaprojektowany do odwrotnej transkrypcji RNA ze zwiększoną wiernością w porównaniu do innych odwrotnych transkryptaz Zoptymalizowany do dwuetapowej RT-PCR
5893151001	Transcriptor Universal cDNA Master	Wygodne, szybkie rozwiązanie do syntezy cDNA i analizy PCR w czasie rzeczywistym< Niezależnie od używanego instrumentu PCR, ta mieszanka wzorcowa, dostarczana w dwóch fiolkach, wykorzystuje pełny potencjał testów qRT-PCR

Enzymy RT - odwrotne transkryptazy

Wybierz z naszej kolekcji enzymów RT i znajdź taki, który odpowiada złożoności transkryptu RNA. Nasze produkty obejmują standardowe odwrotne transkryptazy Avian Myeloblastosis Virus (AMV) i Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV), a także ich ulepszone wersje zapewniające wyższą czułość.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
.A4464	Ulepszona ptasia odwrotna transkryptaza	Większa czułość dla mRNA o niskiej obfitości Najlepszy enzym do transkrypcji przez trudną strukturę drugorzędową
ERT-RO	Expand™ Reverse Transcriptase	Transkrybuje fragmenty cDNA do 13.5 kb Może używać cDNA lub jednoniciowego DNA
M1302	M-MLV Reverse Transcriptase	Używa jednoniciowego RNA, DNA lub hybrydy RNA-DNA Generuje pierwszą nić cDNA do 7 kb
10109118001	Reverse Transcriptase AMV	Zawiera 5X bufor do syntezy pierwszej nici cDNA
11062603001	Reverse Transcriptase M-MuLV	Brak aktywności endonukleazy i znacznie niższa aktywność RNazy H w porównaniu do AMV RT
TRANSRTRO	Transcriptor Reverse Transcriptase	Osiągnij wysoką czułość w dwuetapowym RT-PCR. Odwrotna transkryptaza Transcriptor jest stosowana w konwencjonalnych termocyklerach i urządzeniach do PCR w czasie rzeczywistym (np. LightCycler® Instruments). Odwrotna transkrypcja trudnych szablonów. Enzym działa dobrze w podwyższonych temperaturach, pokonując w ten sposób drugorzędową strukturę RNA (np. szablony RNA bogate w GC) i ułatwiając optymalne warunki reakcji.

Dowiedz się więcej o rozwiązywaniu problemów RT-qPCR w stronie rozwiązywania problemów RT-PCR / RT-qPCR.

qZestawy do qPCR

Produkty ReadyMix^TM zawierają wszystkie niezbędne składniki do qPCR.

Probe Based qPCR

Probe based qPCR opiera się na specyficznym dla sekwencji wykrywaniu pożądanego produktu PCR. W przeciwieństwie do metod qPCR opartych na SYBR^® Green, które wykrywają wszystkie dwuniciowe DNA, qPCR oparty na sondach wykorzystuje sondę znakowaną fluorescencyjnie, co skutkuje zwiększoną specyficznością i czułością. Dodatkowo dostępne są różne barwniki fluorescencyjne, dzięki czemu można stosować wiele starterów do jednoczesnej amplifikacji wielu sekwencji.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
D6442	JumpStart™ Taq ReadyMix™ for High Throughput Quantitative PCR	Gotowa do użycia mieszanina 2x do qPCR z ROX Idealna do wysokoprzepustowych, ilościowych metod PCR z wykorzystaniem wykrywania sond fluorescencyjnych JumpStart™ Taq zapobiega niespecyficznej amplifikacji i zwiększa wydajność docelową
D7440	JumpStart™ Taq ReadyMix™ for Quantitative PCR	Gotowa do użycia mieszanina 2x do wykonywania ilościowych testów PCR, które opierają się na sondzie fluorescencyjnej
L6669	LuminoCt® qPCR ReadyMix™	Idealny do szybkich, wysokowydajnych 2-etapowych protokołów qPCR z wynikami testów w zaledwie 25 minut Do szybkiej ilościowej reakcji PCR opartej na sondach
FSTMPMMRO	FastStart TaqMan® Probe Master	Używaj z dowolnym urządzeniem do qPCR w czasie rzeczywistym innym niż LightCycler® Instrumenty Wybieraj spośród dwóch preparatów - jednego zawierającego barwnik referencyjny ROX i jednego bez ROX Zawiera dUTP, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez przeniesienie
FSUPMMRO	FastStart Universal Probe Master (Rox)	Uzyskaj czułe, specyficzne wyniki w testach z użyciem uniwersalnych sond bibliotecznych lub innych sond hydrolizujących< Aplikuj fragmenty o długości do 500 bp, w tym te, które są bogate w GC lub AT Zawiera dUTP, aby zapobiec przenoszeniu zanieczyszczeń<
PFUKB	KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix, uniwersalny	Kompatybilny ze wszystkimi technologiami opartymi na sondach fluorogenicznych, w tym z sondami hybrydyzacyjnymi (np.g., FRET), sondami hydrolizy (np. TaqMan® probes) i sondami przemieszczenia (np. molecular beacons).

SYBR^® Green Based qPCR

SYBR^® Green I, powszechnie stosowany fluorescencyjny barwnik wiążący DNA, wiąże wszystkie dwuniciowe DNA. Wykrywanie jest monitorowane poprzez pomiar wzrostu fluorescencji w całym cyklu. SYBR^® Green I ma maksima wzbudzenia i emisji odpowiednio 494 nm i 521 nm. Specyficzność naszej detekcji qPCR opartej na SYBR^® Green jest znacznie zwiększona przez włączenie polimerazy Taq z gorącym startem, takiej jak JumpStart™ Taq.

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
KCQS02	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ with ROX™	Dla urządzeń Applied Biosystems® (ABI)
KCQS01	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low ROX™	Dla urządzeń Applied Biosystems® (ABI) i Stratagene®&instrumentów
KCQS00	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	Dla analizatorów Bio-Rad®, Cepheid®, Eppendorf®, Illumina®, Corbett® i Roche® systemy
KCQS03	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ iQ™	Z fluoresceiną dla systemów Bio-Rad®
S4438	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™	Do ilościowego PCR, MgCI2 w buforze
S5193	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™	Do ilościowej reakcji PCR, bez MgCl2 w buforze
S9194	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ for High Throughput qPCR	SYBR® Zielony odczynnik qPCR, pasywny barwnik referencyjny w zestawie
S1816	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ do ilościowej reakcji PCR	Formuła kapilarna SYBR® Zielony odczynnik qPCR do systemów kapilarnych Roche LightCycler®
SFUKB	KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix, Universal	Skonsekwentne wykrywanie słabo kopiowanych i trudnych celów Kompletne przebiegi PCR w czasie rzeczywistym w zaledwie 40 minut<
FSUSGMMRO	FastStart Universal SYBR® Green Master (Rox)	Do amplifikacji i wykrywania dowolnego docelowego DNA lub cDNA, w tym bogatych w GC lub AT Zawiera dUTP, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez przeniesienie
L6544	LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	Do szybkiej ilościowej reakcji PCR SYBR® Green z wynikami testu w zaledwie 25 minut Z oddzielną fiolką ROX Praktycznie eliminuje potrzebę optymalizacji parametrów testu

Dowiedz się więcej na temat SYBR^® Green based qPCR w tym krótkim filmie.

MicroRNA-Based RT-qPCR

.Znajdź produkty do odwrotnej transkrypcji mikroRNA, których potrzebujesz, dzięki naszej linii produktów  MystiCq^® .

MystiCq^® MicroRNA RT-qPCR SystemR

MystiCq^® odczynniki microRNA zapewniają kompletny przepływ pracy SYBR® Green RT-qPCR do ilościowego określania ekspresji w zaledwie trzech krokach:

1. izolacja
2. synteza cDNA
3. kwantyfikacja przez amplifikację

.

Dowiedz się więcej na temat przepływu pracy MystiCq^® na naszej stronie produktu MystiCq^® . Produkty te posiadają:

• Ponad 1400 wstępnie zaprojektowanych i przetestowanych w mokrym laboratorium par starterów zaprojektowanych tak, aby celować tylko w dojrzałe mikroRNA
• Konwersja wszystkich mikroRNA, umożliwiająca niemal nieograniczoną liczbę odczytów z pojedynczej próbki
• Wybór trzech różnych produktów do izolacji mikroRNA<

 

qPCR Assay Designs and Reagents for SARS-CoV-2 Research

Jesteśmy zaangażowani w dostarczanie naukowcom niezawodnych zasobów i narzędzi wspierających walkę z COVID-19 (SARS-CoV-2). W odpowiedzi na zapotrzebowanie społeczności na odczynniki i protokoły specyficzne dla SARS-CoV-2, nasi naukowcy ocenili zestawy One-Step RT-qPCR oparte na RNA do wykrywania celu SARS-CoV-2. Tylko do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Projekt eksperymentalny i metody

Ten eksperyment został przeprowadzony w celu ustalenia, czy nasze zestawy One-Step RT-qPCR mogą wykrywać SARS-CoV-2. Test przeprowadzono zgodnie z protokołem CDC do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu zsyntetyzowanego RNA SARS-Cov-2 jako matrycy, rozcieńczonego do 10⁵, 10⁴, 10³, 10² i 10 kopii. Próbka testowa zawierała matrycę, odczynniki z każdego zestawu, startery DNA specyficzne dla celu /TaqMan^® zestawy sond dla N1 i N2 (N, gen nukleokapsydu). W każdym teście uwzględniono również próbki NTC (bez kontroli szablonu).

Primer Target	F Primer 5'-3'	R Primer, 5'-3'	Sonda	Amplicon Rozmiar
N1	GACCCCAAAATCAGCGAAAT	TCTGTTACTGCCAGTTGAATCTG	5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'	71 bp
N2	TTACAAACATTGGCCGCAAA	GCGCGACATTCCGAAGAA	5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'	67 bp

Tabela 2. Zestawy starterów i sond przeznaczone do specyficznego wykrywania SARS-CoV-2 (testy N1 i N2). Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Wyniki testów

A: Test N1

B: Test N2

Rysunek 2. Testy wykrywania SARS-CoV-2 z wykorzystaniem Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (nr kat. QR200) dla starterów N1 (wykres A) i N2 (wykres B).

Testy wykrywania SARS-CoV-2 N1 (wykres A) i N2 (wykres B) na Rysunku 2 zostały wykonane przy użyciu Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (nr kat. QR200) przy użyciu zsyntetyzowanego RNA SARS-CoV-2 jako matrycy. Oba testy wykazały czułość wykrywania zaledwie 10² kopii matrycy. Nie zaobserwowano amplifikacji w próbkach NTC

A: Test N1

B: Test N2

Rysunek 3. Testy wykrywania SARS-CoV-2 wykorzystujące KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (nr kat. KCQS07) dla starterów N1 (wykres A) i N2 (wykres B).

Testy wykrywania SARS-CoV-2 N1 (wykres A) i N2 (wykres B) na Rysunku 3 przeprowadzono przy użyciu KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (nr kat. Nr  KCQS07) przy użyciu zsyntetyzowanego RNA SARS-CoV-2 jako matrycy. Oba testy wykazały czułość wykrywania zaledwie 10 kopii matrycy. Nie zaobserwowano amplifikacji w próbkach NTC.

A: Test N1

B: Test N2

Rysunek 4. Testy wykrywania SARS-CoV-2 z wykorzystaniem uniwersalnego zestawu KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) (nr kat. KK4752) dla starterów N1 (wykres A) i N2 (wykres B).

Testy wykrywania SARS-CoV-2 N1 (wykres A) i N2 (wykres B) na Rysunku 4 przeprowadzono przy użyciu uniwersalnego zestawu KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) (nr kat.  KK4752) z wykorzystaniem zsyntetyzowanego RNA SARS-CoV-2. Nr  KK4752) przy użyciu zsyntetyzowanego RNA SARS-CoV-2 jako matrycy. Oba testy wykazały czułość wykrywania tak niską jak 10² kopii matrycy. Nie zaobserwowano amplifikacji w próbkach NTC.

A: Test N1

B: Test N2

Rysunek 5. Testy wykrywania SARS-CoV-2 z wykorzystaniem zestawu ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (nr kat. RK20407) dla starterów N1 (wykres A) i N2 (wykres B).

Testy wykrywania SARS-CoV-2 N1 (wykres A) i N2 (wykres B) na Rysunku 5 przeprowadzono przy użyciu zestawu ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (nr kat. Nr  RK20407) przy użyciu zsyntetyzowanego RNA SARS-CoV-2 jako matrycy. Oba testy wykazały czułość wykrywania zaledwie 10 kopii matrycy. Nie zaobserwowano amplifikacji w próbkach NTC.

Wnioski

Powyższe wyniki wskazują, że nasze odczynniki i zestawy One-Step RT-qPCR są idealne do wykrywania celu SARS-CoV-2 w badaniach SARS-CoV-2. W oparciu o te informacje, testy wykorzystujące odczynniki One-Step RT-qPCR mogą wykrywać nawet 100 kopii, a w niektórych przypadkach nawet 10 kopii matrycy RNA.

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Nieopublikowane dane przedstawione w tym artykule technicznym pochodzą z badań wewnętrznych.

Aby uzyskać więcej informacji na temat produktów RT-qPCR do wykrywania SARS-CoV-2, odwiedź Sigma-Aldrich.com/covid19

TRI Reagent^® for Total RNA Isolation

TRI Reagent^® jest idealny do szybkiej, ekonomicznej i wydajnej izolacji całkowitego RNA lub jednoczesnej izolacji RNA, DNA i białek z próbek pochodzenia ludzkiego, zwierzęcego, roślinnego, drożdżowego, bakteryjnego i wirusowego.

Produkt ten, będący mieszaniną tiocyjanianu guanidyny i fenolu w roztworze jednofazowym, skutecznie rozpuszcza DNA, RNA i białka podczas homogenizacji lub lizy próbki tkanki. Po dodaniu chloroformu lub 1-bromo-3-chloropropanu i odwirowaniu, mieszanina rozdziela się na 3 fazy: fazę wodną zawierającą RNA, interfazę zawierającą DNA i fazę organiczną zawierającą białka. Każdy składnik można następnie wyizolować po oddzieleniu faz. Jeden ml odczynnika TRI Reagent^® wystarcza do wyizolowania RNA, DNA i białka z 50-100 mg tkanki, 5-10 ´ 106 komórek lub 10 cm² powierzchni szalki hodowlanej dla komórek hodowanych w monowarstwie.

Jest to jedna z najskuteczniejszych metod izolacji całkowitego RNA, którą można wykonać w ciągu zaledwie 1 godziny, zaczynając od świeżej tkanki lub komórek. Procedura ta jest bardzo skuteczna w izolowaniu cząsteczek RNA wszystkich typów o długości od 0,1 do 15 kb. Uzyskany RNA jest nienaruszony, z niewielką lub żadną ilością zanieczyszczającego DNA i białka. Może być stosowany do Northern blot, izolacji mRNA, translacji in vitro , testu ochrony przed RNazą, klonowania i PCR.

TRI Reagent^® był szeroko stosowany w inaktywacji wirusów i ekstrakcji wirusowego RNA do wykrywania SARS-CoV-2 za pomocą testów RT-qPCR w kilku badaniach naukowych.^{1, 2, 3} Wykazano, że jest idealny do izolacji i przechowywania mi-RNA w temperaturze -80⁰C przez dłuższy czas.⁴ Został użyty do ekstrakcji RNA koronawirusa kotów i psów, który jest następnie wykorzystywany w teście RT-PCR.^{5, 6} Został również użyty do izolacji cytoplazmatycznego RNA z komórek Vero zakażonych SARS-CoV. ⁷

Nr kat.	Nazwa produktu	Właściwości
T9424	Odczynnik TRI®	Do przetwarzania tkanek, komórek hodowanych w monowarstwie lub peletek komórkowych

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Referencje

1. Dimke H, Larsen SL, Skov MN, Larsen H, Hartmeyer GN, Moeller JB. Phenol-chloroform-based RNA purification for detection of SARS-CoV-2 by RT-qPCR: comparison with automated systems. https://doi.org/10.1101/2020.05.26.20099440

2. Alhamlan F, Alqahtani A, Bakheet D, Bohol M, Althawadi S, Mutabagani M, Almaghrabi R, Obeid D. Development and Validation of Two In-house, Low-Cost SARS-CoV-2 Detection Assays. https://doi.org/10.1101/2020.05.18.20105510

3. Toptan T, Hoehl S, Westhaus S, Bojkova D, Berger A, Rotter B, Hoffmeier K, Cinatl J, Ciesek S, Widera M. Optimized qRT-PCR Approach for the Detection of Intra- and Extra-Cellular SARS-CoV-2 RNAs. IJMS. 21(12):4396. https://doi.org/10.3390/ijms21124396

4. Mraz M, Malinova K, Mayer J, Pospisilova S. 2009. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390(1):1-4. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.09.061

5. Gunn-Moore DA, Gruffydd-Jones TJ, Harbour DA. 1998. Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Veterinary Microbiology. 62(3):193-205. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(98)00210-7

6. Erles K, Toomey C, Brooks HW, Brownlie J. 2003. Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology. 310(2):216-223. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(03)00160-0

7. Darnell ME, Subbarao K, Feinstone SM, Taylor DR. 2004. Inactivation of the coronavirus that induces severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV. Journal of Virological Methods. 121(1):85-91. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2004.06.006

*Ten artykuł jest preprintem i nie został zrecenzowany. Raportuje nowe badania medyczne, które nie zostały jeszcze ocenione, a zatem nie powinny być wykorzystywane do kierowania praktyką kliniczną.