Reakcja łańcuchowa polimerazy

A Technical Guide to PCR Technologies

Na tej stronie

• Procedura cykliczna
• Składniki testu PCR.
• Instrumenty
• Modyfikacje PCR specyficzne dla aplikacji

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)^1,2,3 stała się jedną z najczęściej stosowanych technik w biologii molekularnej. Jest wykorzystywana w zastosowaniach od badań podstawowych po wysokowydajne badania przesiewowe. Chociaż jest to potężna technika, powszechne przyjęcie i różnorodny zakres zastosowań wynika z jej pozornej prostoty i stosunkowo niskich kosztów. Technika ta jest stosowana do amplifikacji określonych, docelowych fragmentów DNA z niewielkich ilości źródłowego DNA lub RNA (po etapie odwrotnej transkrypcji w celu wytworzenia komplementarnego DNA (cDNA), patrz odwrotna transkrypcja). Jedną z głównych zalet PCR jest to, że sekwencje docelowe mogą być amplifikowane z pojedynczej kopii materiału wyjściowego, nawet gdy matryca jest zdegradowana i zanieczyszczona inhibitorami. Na przykład, przeprowadzono badania na DNA wyekstrahowanym ze starożytnych mumii egipskich w celu zidentyfikowania członków rodziny króla Tutanchamona⁴. PCR pojawia się nawet w głównych filmach i większości seriali kryminalnych na pewnym etapie "śledztwa", nawet jeśli jest nieco zbyt fabularyzowany. 

PCR Cycling Process

Typowa reakcja PCR składa się z:

• Wstępnej denaturacji: Temperatura reakcji jest zwiększana do 95 °C, a reakcja jest inkubowana przez 2-5 min (do 10 min w zależności od charakterystyki enzymu i złożoności matrycy), aby zapewnić, że wszystkie złożone, dwuniciowe cząsteczki DNA (dsDNA) zostaną rozdzielone na pojedyncze nici w celu amplifikacji.
  
  
• Cykling:
  
  
  1. Denaturacja: Temperatura reakcji wzrasta do 95 °C, co powoduje stopienie (przerwanie wiązań wodorowych między komplementarnymi zasadami) wszystkich dsDNA do jednoniciowego DNA (ssDNA).
     
  2. Annealing:  Temperatura jest obniżana do około 5 °C poniżej temperatury topnienia (T_m) starterów (często 45-60 °C) w celu promowania wiązania starterów z matrycą.
     
  3. Przedłużanie: Temperatura jest zwiększana do 72 °C, co jest optymalne dla aktywności polimerazy DNA, aby umożliwić przedłużenie hybrydyzowanych starterów.
     

• Powtórzenie: Kroki 1-3 są wykonywane w sposób cykliczny, co skutkuje wykładniczą amplifikacją amplikonu (Rysunki 2.1 i 2.2).

PCR składa się z cykli ogrzewania i chłodzenia reakcji. Każde plateau temperaturowe służy do kontrolowania określonego etapu reakcji, a czasy inkubacji zależą od urządzenia, płytek reakcyjnych lub probówek i odczynników. Należy je zoptymalizować dla każdego eksperymentu, zwłaszcza jeśli wymagana jest zwiększona czułość wykrywania⁵.

Faza początkowej denaturacji składa się z okresu w wysokiej temperaturze, podczas którego struktura drugorzędowa złożonego dwuniciowego DNA (dsDNA) jest topiona, aby stać się jednoniciowym DNA (ssDNA). Ponieważ DNA jest poddawane działaniu wysokiej temperatury, faza ta musi być wystarczająco długa, aby oddzielić wszystkie nici, tak aby były dostępne do gruntowania, ale nie tak długa, aby DNA zostało uszkodzone. Degradacja podczas początkowych (lub kolejnych) etapów denaturacji lub niepełna denaturacja skutkuje zmniejszoną czułością wykrywania⁵.

Podczas krótszego etapu denaturacji, który inicjuje cykl (10 s do 1 min w 95 °C), nici DNA sekwencji docelowej rozdzielają się, tworząc pojedyncze nici, podobnie jak w początkowym etapie denaturacji. Reakcja jest następnie schładzana do temperatury wyżarzania starterów.

Etap wyżarzania (od 30 s do 1 min, w temperaturze 45-60 °C) jest wymagany, aby startery wiązały się z komplementarną sekwencją na każdej z pojedynczych nici DNA. Startery są zaprojektowane w taki sposób, aby obejmowały cel zainteresowania, a region sekwencji, który znajduje się między nimi, jest określany jako amplikon. Ogólnie rzecz biorąc, temperaturę wyżarzania można oszacować na 5 °C niższą niż temperatura topnienia dupleksu DNA starter-podkład.

Ostatnim etapem jest etap wydłużania (20 s do 1 min w 72 °C), który jest wykonywany tak, aby polimeraza DNA wydłużała sekwencje starterów od 3' każdego startera do końca amplikonu. Wydłużenie o 1 minutę jest zazwyczaj wystarczające do syntezy fragmentów PCR do 2 kilobaz (kb). Aby amplifikować większe fragmenty, etap wydłużania jest wydłużany z szybkością 1 min na kb. Podczas pierwszego wydłużania, szablon nie będzie ograniczał długości, a więc będą syntetyzowane szablony, które przekraczają długość amplikonu. W kolejnych etapach wydłużania długość amplikonu będzie określona przez sekwencję starterów na każdym końcu.

Rysunek 2.1. Schemat poszczególnych procesów reakcji w typowym PCR.

Rysunek 2.2. W teoretycznym PCR ilość docelowego amplikonu podwaja się z każdym cyklem, co prowadzi do wykładniczej amplifikacji sekwencji docelowej (oś X pokazuje cykle PCR, a oś Y pokazuje całkowitą liczbę cząsteczek amplikonu).

Na początku drugiego cyklu w reakcji znajdują się dwie formy matrycy: oryginalne nici DNA i nowo zsyntetyzowane nici DNA, składające się z sekwencji startera, a następnie zmiennej długości amplikonu przedłużonego na końcu 3'. Pozostałe oryginalne nici DNA, które nie zostały zagruntowane w pierwszym cyklu, mogą zostać wychwycone w drugim i skutkować cząsteczkami składającymi się ze startera i produktu przedłużenia. Cząsteczki z pierwszego cyklu, które zostały zagruntowane i wydłużone, będą szablonem dla starterów, które są komplementarne do nowo zsyntetyzowanego materiału.

W trzecim cyklu nowo zsyntetyzowany DNA regionu docelowego wynikający z drugiego cyklu zawiera tylko amplikon i dlatego staje się specyficznym szablonem.

Cykle są powtarzane w sposób ciągły, co powoduje wykładniczą amplifikację skopiowanych sekwencji (Rysunek 2.2). Liczba wymaganych cykli zależy od pożądanej wydajności produktu PCR. To z kolei zależy od początkowej liczby kopii i wydajności amplifikacji. Ponieważ względne stężenie materiału wyjściowego do produktu końcowego jest niewiarygodnie niskie (np, 1/5,5¹¹ jeśli pojedyncza cząsteczka jest poddawana 40 cyklom amplifikacji i osiągana jest 100% wydajność w każdym cyklu, Rysunek 2.1), powstałe DNA na końcu reakcji jest prawie wyłącznie amplikonem PCR.

Chociaż teoretyczny PCR powinien skutkować ciągłą amplifikacją wykładniczą, reakcja ostatecznie osiąga fazę plateau. Wydaje się, że jest to spowodowane niespecyficznym wiązaniem polimerazy DNA z produktami DNA^6,7. Jest to wyraźnie widoczne podczas stosowania ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i monitorowania zmian w etykietach fluorescencyjnych (patrz Quantitative PCR).

Pod koniec reakcji produkty amplifikacji są analizowane za pomocą elektroforezy żelowej. W zależności od wyprodukowanej ilości i wielkości amplifikowanego fragmentu, produkty reakcji mogą być wizualizowane bezpośrednio poprzez barwienie żelu bromkiem etydyny (Rysunek 2.3) lub przy użyciu ostatnio wprowadzonych barwników, takich jak BlueView™ ⁸.

Rysunek 2.3. Przykład konwencjonalnych produktów PCR rozpuszczonych w żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Przeprowadzono dupleksową reakcję PCR w celu wykrycia 2 celów jednocześnie, z których każdy różni się rozmiarem. Oba fragmenty można zobaczyć jako odrębne pasma (zdjęcie dzięki uprzejmości Marion Grieβl).

Składniki testu PCR

Poniżej znajduje się podsumowanie składników, które są wymagane do przeprowadzenia reakcji PCR. Wiele z nich opisano bardziej szczegółowo w dedykowanych rozdziałach, a także w szczegółowych, standardowych protokołach PCR na końcu tego przewodnika (Załącznik A).

Szablon

Istnieje kilka dostępnych metod oczyszczania RNA i DNA. Chociaż wszystkie są odpowiednie, nie wszystkie mogą być sobie równe. Zanieczyszczenie matrycy innymi materiałami ze źródła próbki może skutkować zahamowaniem PCR, a w skrajnych przypadkach całkowitym niepowodzeniem testu. Istnieją przykłady, które pokazują, że zanieczyszczenia mogą nawet powodować wzmocnienie reakcji^9,10. Patrz Oczyszczanie próbek i ocena jakości aby uzyskać więcej informacji na temat oczyszczania szablonów i kontroli jakości oraz Odwrotna transkrypcja w celu uzyskania informacji dotyczących reakcji odwrotnej transkrypcji (RT). Zazwyczaj 10 ng do 1 μg genomowego DNA (gDNA) dodaje się do 20-100 μL testów PCR, podczas gdy reakcje syntezy cDNA rozcieńcza się od 1/5 do 1/10, a 5 μL dodaje się do 20-50 μL reakcji.

Prymery

Prymery oligonukleotydowe mają zazwyczaj długość 15-25 nukleotydów z 40-60% GC i T_m który jest podobny dla każdego
członka pary. Prostą metodą oceny T_m krótkich oligos (<25 zasad) jest użycie wzoru¹¹:

T_m = 4(G + C) + 2(A + T)

Zobacz PCR/qPCR/dPCR Assay Design aby uzyskać więcej informacji na temat projektowania i obsługi starterów. Szacuje się, że idealna temperatura początkowa do wyżarzania jest o 5 °C niższa niż temperatura topnienia. Temperaturę wyżarzania można zoptymalizować za pomocą bloku PCR z gradientem temperatury. Protokół optymalizacji temperatury (na przykładzie qPCR) podano w Załączniku A.

Polimerazy DNA

Istnieje duża różnorodność enzymów polimerazy DNA i bardzo ważne jest, aby wybrać odpowiedni enzym na podstawie definicji eksperymentu (a nie tylko dostępności danego enzymu w zamrażarce laboratoryjnej). Na przykład niektóre enzymy są zaprojektowane tak, aby były nieaktywne w niskich temperaturach i są używane w protokołach gorącego startu w celu zmniejszenia niespecyficznej amplifikacji, podczas gdy inne mają niski poziom błędów i są wybierane do amplifikacji fragmentów do klonowania.

dNTP

Stężenie każdego dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) w PCR wynosi zwykle 200 μM. Jednak stężenie dNTP musi być w nadmiarze i może wymagać zwiększenia w celu amplifikacji długich fragmentów lub bardzo obfitych celów. Ostatnio pojawiły się ulepszenia składników buforów PCR, takie jak CleanAmp™ dNTPs¹². Są to zmodyfikowane trifosforany nukleozydów, które blokują przyłączanie nukleotydów polimerazy DNA.  CleanAmp dNTPs są aktywowane przez początkowy etap ogrzewania i kolejne etapy denaturacji w typowych warunkach cyklu gorącego startu. Proces ten ogranicza ilość dostępnych aktywowanych dNTP podczas każdego cyklu PCR, co pozwala na bardziej specyficzną i wydajną amplifikację pożądanego produktu. Z kolei redukują lub całkowicie unikają niewłaściwego primerowania lub tworzenia dimerów starterów, a zatem stanowią alternatywę dla polimeraz DNA typu hot start.

MgCl₂ Stężenie

Wolne jony Mg²⁺ są wymagane jako kofaktor dla aktywności polimerazy DNA, jednak jony Mg²⁺ tworzą kompleksy z dNTP, starterami i szablonami DNA. Z tego powodu optymalne stężenie  MgCl₂ musi być wybrane dla każdego eksperymentu poprzez testowanie reakcji zawierających różne stężenia. Stężenie MgCl₂ wynosi zwykle między 1,5-5.5 mM, ale może być testowane w zakresie 1-8 mM podczas optymalizacji (patrz  Assay Optimization and Validation).

Fluorescent Labels

Barwniki fluorescencyjne są włączane do reakcji, gdy amplikon ma być wykrywany bezpośrednio, na przykład przy użyciu zestawu qPCR lub cyfrowego PCR (dPCR). Są one zawarte w buforze lub dołączone do starterów lub dodatkowych sond (patrz Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods).

Instrumenty

Pierwotnie przeprowadzanie reakcji PCR było pracochłonne, ponieważ polegało na fizycznym przenoszeniu probówek reakcyjnych między 3 łaźniami wodnymi, z których każda była ustawiona na wymaganą temperaturę denaturacji, annealingu i elongacji. Olej był dodawany do górnej części reakcji, aby zapobiec parowaniu, a analiza była trudna do przeprowadzenia bez zakłóceń ze strony oleju. Obecnie powszechne jest korzystanie z jednego z wielu specjalistycznych przyrządów do cykli termicznych, które są dostępne w handlu. Formaty płytek i bloków różnią się między 48-, 96- lub 384-dołkowymi i są kompatybilne z pipetami wielokanałowymi. Większość z nich wykorzystuje podgrzewaną pokrywę, która eliminuje potrzebę stosowania nakładki olejowej. Istnieją jednak wysokowydajne instrumenty oparte na oryginalnej zasadzie łaźni wodnej¹³.

Modyfikacje PCR specyficzne dla aplikacji

Różne pochodne PCR wymagają modyfikacji reakcji. Niektóre z tych modyfikacji dla popularnych zastosowań są zawarte tutaj.

Cloning

PCR może być używany do amplifikacji wybranych sekwencji w celu wstawienia ich do wektora. Sekwencje te mogą być modyfikowane w celu włączenia określonych regionów (ogonów) do rozpoznawania enzymów klonujących. Primery skierowane do wektora są używane do izolowania fragmentów, które zostały już sklonowane do wektorów. Enzym polimerazy DNA o niskim poziomie błędu jest niezbędny do etapów PCR.

Sequence Tag Sites

Są one zaprojektowane na końcu 5' starterów i są używane podczas sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, gdy specyficzny znacznik jest wymagany jako wskaźnik, że określony segment genomu określonej próbki jest obecny w wybranym klonie, tak aby dane sekwencji genomowej mogły zostać zdekomponowane i przypisane do oryginalnej próbki źródłowej.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce

W celu zbadania funkcji białka, pożądana mutacja może zostać wprowadzona do sekwencji DNA. Pożądana zmiana zasady jest wprowadzana do starterów (w kierunku końca 5'), które zawierają również wymagane miejsca restrykcyjne enzymu klonującego. Alternatywne podejście przyjmuje wieloetapowy protokół, w którym startery, które są specyficzne dla celu i zawierają miejsca klonowania, są używane w połączeniu ze starterami zawierającymi pożądaną mutację.

Referencje

1. Saiki R, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Horn G, Erlich H, Arnheim N. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230(4732):1350-1354. https://doi.org/10.1126/science.2999980

2. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51(0):263-273. https://doi.org/10.1101/sqb.1986.051.01.032

3. Mullis KB, Faloona FA. 1987. [21] Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.335-350. https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)55023-6

4. Hawass Z. 2010. Ancestry and Pathology in King Tutankhamun's Family. JAMA. 303(7):638. https://doi.org/10.1001/jama.2010.121

5. Douglas A, Atchison B. 1993. Degradation of DNA during the denaturation step of PCR.. Genome Research. 3(2):133-134. https://doi.org/10.1101/gr.3.2.133

6. Morrison C, Gannon F. 1994. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1219(2):493-498. https://doi.org/10.1016/0167-4781(94)90076-0

7. Kainz P. 2000. The PCR plateau phase ? towards an understanding of its limitations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1494(1-2):23-27. https://doi.org/10.1016/s0167-4781(00)00200-1

8. BlueView Nucleic Acid Stain. 2012; Product No. T9060.

9. Witt N, Rodger G, Vandesompele J. An assessment of air as a source of DNA contamination encountered when performing PCR. J Biomol Tech2009; 20: .236-240.

10. Huggett JF, Novak T, Garson JA, Green C, Morris-Jones SD, Miller RF, Zumla A. 2008. Differential susceptibility of PCR reactions to inhibitors: an important and unrecognised phenomenon. BMC Research Notes. 1(1):70. https://doi.org/10.1186/1756-0500-1-70

11. Wallace RB, Shaffer J, Murphy R, Bonner J, Hirose T, Itakura K. 1979. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to ?X174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucl Acids Res. 6(11):3543-3558. https://doi.org/10.1093/nar/6.11.3543

12. CleanAmp. 2012; Product No. DNTPCA1.

13. GC Biotech. Hydrocycler. GC Biotech 2012.