Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaSynteza peptydówRozszczepianie i deprotekcja żywicy Fmoc

Rozszczepianie i deprotekcja żywicy Fmoc

Spis treści

Wprowadzenie

Po udanej syntezie zabezpieczonego peptydu, stajemy przed trudnym zadaniem jednoczesnego odłączenia peptydu od nośnika żywicznego i usunięcia wszystkich grup zabezpieczających łańcuchy boczne reszt aminokwasowych w celu uzyskania pożądanego peptydu. W Fmoc SPPS etap ten jest zwykle przeprowadzany poprzez traktowanie żywicy peptydylowej TFA. Podczas tego procesu generowane są wysoce reaktywne formy kationowe z grup ochronnych i uchwytów na żywicy, które mogą, o ile nie zostaną uwięzione, reagować z tymi resztami, które zawierają nukleofilowe grupy funkcyjne, a tym samym je modyfikować: Trp, Met, Tyr i Cys. Aby temu zapobiec, różne odczynniki nukleofilowe (znane jako zmiatacze) są dodawane do TFA w celu wygaszenia tych jonów1, 2

Zaproponowano wiele uniwersalnych mieszanin rozszczepiających, z których najpopularniejszą jest Reagent K (TFA/woda/fenol/tioanizol/EDT [82.5:5:5:5:2.5])1. Jednak postęp w technologii grup ochronnych i łączników, w szczególności wprowadzenie pochodnych Fmoc-Trp(Boc) i Fmoc-Arg(Pmc/Pbf), takie złożone mieszaniny zawierające toksyczne i nieprzyjemne zapachy odczynniki nie są już konieczne, z wyjątkiem wyjątkowych okoliczności.

Większość problemów może być złagodzona przez odpowiedni wybór chronionej pochodnej aminokwasu i żywicy (Tabela 1).  Jeśli te zalecenia są przestrzegane, użycie TFA/TIS/woda (95:2,5:2,5) będzie wystarczające dla większości sekwencji.Istnieją oczywiście sekwencje, zwłaszcza te, które zawierają cysteinę i liczne t- reszty chronione butylem, dla których ta mieszanina nie daje zadowalających wyników; w takich przypadkach zaleca się dodanie EDT do mieszaniny lub użycie odczynnika K.Niemniej jednak, jako ogólny, bezzapachowy koktajl rozszczepiający, mieszanina ta okazała się niezwykle skuteczna.

Dla tych, którzy nie chcą korzystać z zaleceń podanych w Tabeli 1>, schemat przedstawiony na Rysunku 1 pomoże w wyborze najbardziej odpowiedniej mieszaniny.

Tabela 1:Zalecana grupa ochronna i strategia dotycząca żywicy.

Usuwanie N-końcowej grupy Fmoc

Przed wykonaniem kwasowego rozszczepienia żywicy peptydylowej, N-końcowa grupa Fmoc musi zostać usunięta przy użyciu piperydyny. Sprawdź instrukcję obsługi swojego syntezatora; wiele syntezatorów automatycznie zaprogramuje usunięcie N-końcowej grupy Fmoc jako ostatni etap syntezy.

Przygotowanie żywicy peptydowej do rozszczepienia

Żywicę peptydową należy dokładnie umyć, zwłaszcza gdy podczas syntezy używany jest DMF, ponieważ jest on nielotny, a pozostałości zasadowego DMF mogą mieć wyraźny wpływ hamujący na kwasolizę TFA. W przypadku nośników opartych na PEG i poliakryloamidach pożądane jest przemywanie łagodnie kwaśnym odczynnikiem, takim jak kwas octowy, który nie powoduje uwalniania peptydu, ponieważ te rodzaje żywicy mają tendencję do zatrzymywania DMF3. Dokładne płukanie i suszenie musi być przeprowadzone przed rozszczepieniem (Metoda 1).

Uwaga: Kwas octowy nie powinien być używany do płukania żywic Rink acid, TGT lub 2-chlorotritylowych.

Metoda 1: Przygotowanie żywicy peptydowej do rozszczepienia

  1. Umieść żywicę peptydową w lejku ze szkła spiekanego i zastosuj odsysanie.
  2. Przemyć DMF, kwasem octowym, a następnie DCM kilka razy. Przemyć dalej MeOH (polistyren) lub eterem (poliakryloamid) w celu obkurczenia żywicy.
  3. Usuń żywicę peptydową i susz pod wysoką próżnią przez 4 godziny, lub najlepiej o/n, nad KOH.

Rozszczepianie i deprotekcja TFA

Optymalne warunki rozszczepiania w dużym stopniu zależą od poszczególnych reszt aminokwasowych, ich liczby i sekwencji, grup zabezpieczających łańcuchy boczne oraz rodzaju łącznika przyłączonego do żywicy.

Ze względu na zmienność w zachowaniu różnych żywic peptydowych, zaleca się przeprowadzenie wstępnego rozszczepienia żywicy peptydowej na małą skalę przy użyciu 20-50 mg próbki w celu określenia optymalnych warunków rozszczepienia, takich jak wybór zmiatacza (zmiataczy) i długości reakcji.

Umożliwi to określenie stopnia rozszczepienia (np. poprzez analizę ilościową aminokwasu referencyjnego przyłączonego do łącznika, w stosownych przypadkach) oraz jakości surowego rozszczepionego peptydu (za pomocą HPLC i analizy aminokwasów). W przypadku większości peptydów, pod warunkiem przestrzegania zaleceń podanych w Tabeli 1 , na rozszczepienie można wpływać za pomocą TFA/TIS/wody (95:2,5:2,5).  W przypadkach, w których występują problemy, użycie odczynnika K lub dodanie EDT do powyższej mieszaniny zazwyczaj zapewnia zadowalające rozwiązanie.

W przypadku żywicy Rink Amide, wiązanie eteru fenylobenzylowego, które łączy uchwyt z żywicą, jest wrażliwe na kwasy i może zostać zerwane, zwłaszcza gdy uwalnianie produktu jest powolne podczas reakcji rozszczepiania, co skutkuje kolorowymi produktami ubocznymi, które nie są łatwo usuwane z produktu przez proste płukanie.Można tego uniknąć stosując 2-etapową procedurę opisaną w Metodzie 3 lub lepiej stosując zmiatacze silanu.Kroki te nie są konieczne w przypadku żywic zawierających bardziej stabilne zmodyfikowane łączniki Rink, takie jak żywice Rink Amide AM, Rink Amide MBHA i NovaSyn® TGR.

Metionina, cysteina i tryptofan są niezwykle podatne na alkilację przez kationy wytwarzane podczas procesu rozszczepiania. Reakcja tryptofanu, metioniny lub cysteiny z kationami butylowymi powoduje modyfikację peptydu produktu; reakcja z kationem łącznikowym powoduje nieodwracalne ponowne przyłączenie peptydu do żywicy3. W przypadku metioniny może wystąpić dalsza reakcja prowadząca do powstania homoseryny i fragmentacji łańcucha peptydowego. Dodając zmiatacze do mieszaniny rozszczepiającej, te reakcje uboczne mogą być w znacznym stopniu stłumione. Jednym z wyjątków jest sulfonowanie tryptofanu przez produkty powstające podczas rozszczepiania reszt argininowych chronionych przez Mtr, Pmc i Pbf4. Na szczęście tę reakcję uboczną można wyeliminować stosując Fmoc-Trp(Boc)5-8. Pochodna ta hamuje również ponowne przyłączenie reszt Trp z C-końca do kationu generowanego na łączniku żywicznym. Wykazano również, że grupy ochronne na bazie sulfonylu są związane z tworzeniem się N-sulfonowanych Arg9 oraz O--sulfonowanych Ser i Thr10.

Najczęściej stosowanym zmiataczem jest EDT. Jest on nie tylko bardzo dobrym zmiataczem kationów butylowych, ale także pomaga w usuwaniu tritylowej grupy ochronnej z cysteiny i jest szczególnie skuteczny w zapobieganiu katalizowanemu kwasem utlenianiu reszt tryptofanu.

Tłumienie katalizowanego kwasem utleniania Met można przeprowadzić poprzez włączenie siarczku etylu metylu (EMS), EDT lub tioanizolu do mieszaniny zmiataczy; chociaż tworzenie sulfotlenku metioniny można zminimalizować, przeprowadzając reakcję rozszczepiania pod azotem, zapewniając, że do wytrącania produktu używany jest tylko eter wolny od nadtlenków, a wszystkie rozpuszczalniki są dokładnie odgazowane przed użyciem. Wiadomo również, że tioanizol przyspiesza usuwanie Arg(Mtr/Pmc/Pbf) w TFA; zaleca się jednak zachowanie ostrożności podczas stosowania tego odczynnika, ponieważ istnieją dowody sugerujące, że może on powodować częściowe usunięcie grup ochronnych Acm, tButhio lub tBu z reszt Cys11.

fmoc-flow

Rysunek 1: Schemat blokowy wyboru koktajlu rozszczepiającego dla Fmoc SPPS

Uważa się, że fenol zapewnia pewną ochronę resztom Tyr i Trp1. Trialkilosilany, takie jak TIS i TES, okazały się skutecznymi, bezzapachowymi substytutami EDT12, szczególnie dla peptydów zawierających Arg(Pmc) i Trp(Boc)5, 8. Odczynniki te są również bardzo skuteczne w wygaszaniu wysoce stabilizowanych kationów uwalnianych podczas rozszczepiania Trt 12, Tmob13, i łącznika Rink Amide, dlatego ich stosowanie jest zdecydowanie zalecane, gdy te ugrupowania są obecne.

Gdy w peptydzie występuje kilka mniej kwasolabilnych grup ochronnych lub peptyd jest długi i dlatego zawiera liczne grupy ochronne, czas rozszczepiania zwykle musi zostać znacznie wydłużony. Grupa Mtr jest mniej kwasolubna niż grupy PMC lub Pbf, a jej całkowite usunięcie może zająć nawet 24 godziny. W takich przypadkach, gdy Trp występuje z kilkoma grupami zabezpieczającymi Mtr, niezwykle przydatna jest możliwość optymalizacji warunków rozszczepiania poprzez monitorowanie usuwania tej grupy zabezpieczającej za pomocą HPLC. Należy osiągnąć kompromis między częściowo zmodyfikowanym tryptofanem peptydem a niepełną deprotekcją Arg(Mtr). Dlatego w przypadku peptydów zawierających Trp zdecydowanie zaleca się stosowanie pochodnych Trp(Boc), aby uniknąć modyfikacji łańcucha bocznego tryptofanu.

W przypadku długich peptydów może być konieczne zastosowanie wydłużonego czasu rozszczepiania, aby całkowicie usunąć całą ochronę łańcucha bocznego. Jeśli całkowita deprotekcja nie zostanie osiągnięta w ciągu 6 godzin, peptyd należy wytrącić eterem, a rozszczepienie powtórzyć przy użyciu świeżych odczynników. W celu znalezienia optymalnego trybu rozszczepiania należy przeprowadzić rozszczepienia testowe. Niekompletna deprotekcja łańcucha bocznego jest często pomijana jako przyczyna niepowodzenia w syntezie długich peptydów.

Zaobserwowano problemy z powolną deprotekcją N-końcowych reszt Asn(Trt). Można je łatwo przezwyciężyć, wydłużając czas rozszczepiania do 4 godzin lub stosując Asn(Dmcp) zamiast Asn(Trt).

Metoda 2: Ogólne rozszczepienie TFA

PRZESTROGA: TFA jest niezwykle żrącą cieczą; podczas stosowania tego odczynnika należy zachować szczególną ostrożność. Właściwa ochrona oczu, fartuch laboratoryjny i rękawice są obowiązkowe. Należy przestrzegać lokalnych, stanowych/prowincjonalnych i federalnych przepisów bezpieczeństwa.

  1. Umieść suchą żywicę w kolbie i dodaj roztwór TFA zawierający odpowiednie zmiatacze (10-25 ml/g żywicy, rysunek 1). UWAGA: należy wykonać obliczenia, aby zapewnić wystarczającą ilość zmiatacza dla jakości peptydu i obecnych grup ochronnych. Zamknąć kolbę i pozostawić w temperaturze rt, od czasu do czasu mieszając. Czas reakcji zależy od sekwencji (patrz "Monitorowanie reakcji rozszczepiania", poniżej).
  2. Usuń żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Przemyć żywicę dwukrotnie za pomocą TFA. Połączyć filtraty i dodać (kroplami) 8-10-krotną objętość zimnego eteru. Czasami konieczne jest odparowanie większości TFA w celu uzyskania dobrego wytrącenia surowego peptydu. Eter można schłodzić lodem, aby dodatkowo wspomóc wytrącanie.
  3. Wyizolować peptyd zgodnie z Metodą 17.

Metoda 3: Dwuetapowa procedura odszczepiania/zabezpieczania żywicy amidowej Rink

  1. Zawiesić żywicę w 10% TFA w DCM i wlać do szklanego lejka z drobnym spiekiem.
  2. Pozwolić rozpuszczalnikowi powoli przesiąkać przez złoże żywicy. Przemyć żywicę 5% TFA, pozwalając jej powoli przenikać przez złoże żywicy. Odłączanie jest równowagą katalizowaną kwasem, dlatego ważne jest, aby stale usuwać odłączony peptyd za pomocą tej metody przepływu. Przeprowadzenie reakcji w kolbie nie zapewni całkowitego odłączenia. Wydajność można poprawić dodając 1-5% TIS do mieszaniny rozszczepiającej.
  3. Usuń nadmiar TFA/DCM pod zmniejszonym ciśnieniem i zakończ deprotekcję 95% TFA plus zmiatacze, zgodnie ze składem aminokwasowym (patrz Rysunek 1).

Monitorowanie reakcji rozszczepiania

Obecność chronionej Mtr argininy w peptydzie wymaga długich czasów reakcji, wahających się od 3 do 6 godzin, w zależności od wyboru zastosowanych zmiataczy (Rysunek 1). Wiele reszt argininy może wymagać wydłużenia czasu reakcji do 24 godzin. W takich przypadkach niezwykle przydatna jest możliwość optymalizacji warunków rozszczepiania poprzez monitorowanie usuwania tej grupy ochronnej za pomocą HPLC.

Ogólne protokoły obejmujące silne kwasy

Jako alternatywę dla TFA, do szybkiej deprotekcji mniej kwasolubnych grup zabezpieczających łańcuchy boczne, takich jak Arg(Mtr/Pmc/Pbf), Asn(Mbh) i Gln(Mbh), można użyć silniejszych kwasów z odpowiednimi zmiataczami bez zgłaszania reakcji ubocznych.

Rozszczepianie żywicy przy użyciu bromku trimetylosililowego14

Długie czasy rozszczepiania często uznawane za niezbędne do całkowitej deprotekcji peptydów zawierających wiele reszt Arg(Mtr) mogą prowadzić do poważnego pogorszenia jakości produktu. W szczególności, przedłużona ekspozycja peptydów zawierających tryptofan na EDT w TFA może prowadzić do modyfikacji reszt tryptofanowych w wyniku tworzenia ditioketalu. Rozszczepianie za pomocą bromku trimetylosililowego (TMSBr) eliminuje te problemy, ponieważ wykazano, że odczynnik ten czysto usuwa do 4 reszt Arg(Mtr) w ciągu 15 minut. Ponadto stwierdzono, że metoda ta całkowicie eliminuje powstawanie produktów ubocznych sulfonowania, nawet w przypadku stosowania niezabezpieczonego tryptofanu15.

Metoda 4: Rozszczepianie za pomocą TMSBr

  1. Dodaj TMSBr (1.32 ml) do roztworu EDT (0,50 ml), m-krezolu (0,1 ml) i tioanizolu (1,17 ml) w TFA (7,5 ml) schłodzonego do temperatury 0°C. Dodać żywicę peptydową (200 mg) i pozostawić mieszaninę na 15 minut pod kocem N2 w temperaturze 0°C.
  2. Usuń żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem. Przemyć żywicę dwukrotnie czystym TFA. Połączyć filtraty i dodać (kroplami) 8-10-krotną objętość zimnego eteru. Czasami konieczne jest odparowanie większości TFA w celu uzyskania dobrego wytrącenia surowego peptydu. Eter można schłodzić lodem, aby jeszcze bardziej wspomóc wytrącanie.
  3. Izolować peptyd zgodnie z opisem w Metodzie 17.

UWAGA: Czasami wymagana jest dodatkowa obróbka peptydu fluorkiem amonu w celu odwrócenia sililacji, która mogła wystąpić.

Cleavage from very acid-sensitive resins

The Rink Acid resin16, 2-chlorotrityl17, HMPB18, NovaSyn TGT19, i żywice Sieber20 zawierają wysoce wrażliwe na kwasy łączniki i są odpowiednie do syntezy chronionych peptydów.

Żywice HMPB & żywice amidowe Sieber

W pełni chronione kwasy peptydowe mogą być generowane z łącznika HMPB21 i chronionych amidów z żywicy amidowej Sieber20. Jednakże, aby uniknąć przedwczesnej utraty grup zabezpieczających łańcuchy boczne, niezbędne jest staranne eksperymentowanie. Powtarzalne traktowanie żywicy peptydylowej roztworem 1% roztworu TFA w dichlorometanie w połączeniu z minimalnymi czasami reakcji da najlepsze wyniki.

Oczywiście, rozszczepienie powinno być przeprowadzone w szczelnym lejku ze szkła spiekanego, aby zapobiec parowaniu wysoce lotnego DCM, a filtracja powinna być przeprowadzona przez zastosowanie ciśnienia azotu, a nie przy użyciu próżni.

Jeśli peptyd zawiera Met lub Trp, 1% EDT należy dodać do mieszaniny rozszczepiającej, aby zapobiec ponownemu przyłączeniu peptydu. Jeśli peptyd zawiera C-końcową resztę Trp, zdecydowanie zaleca się stosowanie Trp(Boc)21.

W tej procedurze stopniowej, siła kwasu wzrasta stopniowo, zgodnie z ilością obecnych grup buforujących TFA. Maksymalne stężenie peptydu może być zawarte w pierwszym lub jednym z późniejszych płukań, w zależności od zdolności buforowania wiązań amidowych i innych obecnych grup funkcyjnych. Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne typu t-butylowego, jak również Trt (na Asn i Gln) pozostają całkowicie nienaruszone podczas tego procesu21.

Metoda 5: Rozszczepianie rozcieńczonym TFA

  1. Wstępnie zalać suchą żywicę (1 g) DCM w zamykanym lejku ze szkła spiekanego i usunąć nadmiar DCM.
  2. Dodaj 1% TFA w suchym DCM (10 ml), zamknij lejek i wstrząsaj przez 2 minuty. Przefiltrować roztwór stosując ciśnienie azotu do kolby zawierającej 10% pirydyny w metanolu (2 ml).
  3. Powtórzyć krok 2 do 10 razy, przemyć resztki chronionego peptydu z żywicy za pomocą 3 x 30 ml DCM, 3 x 30 ml MeOH, 2 x 30 ml DCM, 3 x 30 ml MeOH i sprawdzić filtraty za pomocą TLC lub HPLC.
  4. Połączyć filtraty zawierające produkt i odparować pod zmniejszonym ciśnieniem do 5% objętości. Dodać wodę (40 ml) do pozostałości i schłodzić mieszaninę lodem, aby wspomóc wytrącanie produktu.
  5. Odizolować produkt przez filtrację przez lejek ze szkła spiekanego. Przemyć produkt trzykrotnie świeżą wodą. Wysuszyć próbkę w eksykatorze pod próżnią nad KOH, a następnie nad P2O5.

2-Chlorotrityl, NovaSyn® TGT i żywice NovaPEG Trt

2-Chlorotrityl17, NovaSyn® TGT19 i żywice NovaPEG Trt można rozszczepiać za pomocą 1% TFA, jak opisano powyżej, lub w łagodniejszych warunkach za pomocą AcOH lub TFE 22 w celu wytworzenia chronionych peptydów. Podczas przygotowywania chronionych peptydów szczególnie zaleca się stosowanie Fmoc-His(Clt)-OH do wprowadzenia histydyny. Pomaga to uniknąć częściowej deprotekcji łańcucha bocznego histydyny, która może wystąpić, gdy używany jest His(Trt).

Metoda 6: Rozszczepianie za pomocą TFE/DCM

1.   Traktować żywicę peptydylową w rt z TFE/DCM (2:8) przez 3 x1 h.

2.   Po odpowiednim czasie usunąć żywicę przez filtrację, przemyć 3 razy mieszaniną rozszczepiającą.

3.Odparować roztwór do sucha i wytrącić zabezpieczony peptyd za pomocą eteru.

Odłączony, w pełni zabezpieczony peptyd będzie bardzo hydrofobowy i może wymagać dalszej ekstrakcji z żywicy za pomocą DMF, DMSO. Kompletność rozszczepienia można sprawdzić za pomocą TLC filtratów. Oczyszczanie przez chromatografię niskociśnieniową na żelu krzemionkowym, HPLC na krzemionce fenylowej lub przez rekrystalizację.

Peptydy przyłączone za pomocą łącznika HMBA i oksymu

W przypadku syntezy karboksyamidów peptydowych łącznik HMBA został w dużej mierze wyparty przez łączniki typu Rink Amide. Niemniej jednak, łącznik ten jest nadal jednym z najbardziej elastycznych łączników peptydowo-żywicznych. Peptydy mogą być uwalniane z łącznika za pomocą wielu różnych nukleofili, dając peptydy z różnymi grupami funkcyjnymi na C-końcu3, 22 -25  (Tabela 2). Protokoły te są również kompatybilne z łącznikiem oksymowym stosowanym w Boc SPPS.

Tabela 2:Produkty rozszczepienia łącznika HMBA.

Metoda 7: Metanolowe rozszczepienie amoniakiem w celu otrzymania amidów peptydowych3, 23

  1. Umieścić suchą żywicę w kolbie i dodać 95% wodny TFA (20 ml/g). Zamknąć kolbę i pozostawić w temperaturze rt na 1 godzinę, od czasu do czasu mieszając.
  2. Odizolować żywicę przez filtrację pod zmniejszonym ciśnieniem i przemyć TFA. Odrzucić filtrat. Przemyć żywicę DCM, 10% DIPEA w DCM, DCM.  Wysuszyć żywicę pod próżnią nad P2O5 o/n.
  3. Umieść wysuszoną żywicę w czystym, suchym naczyniu ciśnieniowym i wystarczającą ilość DMF do spęcznienia żywicy, a następnie roztwór suchego metanolu nasyconego amoniakiem w temperaturze 0°C (20 ml/g).
  4. Zamknij kolbę i pozwól jej ogrzać się do temperatury rt. Pozostawić na 18 godzin, a następnie ponownie schłodzić kolbę do temperatury 0°C. Ostrożnie otwórz schłodzone naczynie i przefiltruj żywicę przez lejek ze szkła spiekanego.
  5. Przemyj żywicę najpierw metanolem, a następnie TFA do oddzielnej kolby, aby usunąć nierozpuszczalny w metanolu peptyd.
  6. Odparuj filtraty oddzielnie do sucha na wyparce obrotowej. Wytrącić peptyd za pomocą eteru i wyizolować go przez filtrację.

UWAGA: Jeśli żywica peptydowa nie zostanie dokładnie wysuszona przed tą procedurą rozszczepiania, kwas peptydowy może zostać uzyskany jako produkt uboczny.

Metoda 8: Rozszczepienie hydrazyną w celu otrzymania C-końcowego hydrazydu24

Jeśli jest to wymagane, grupy zabezpieczające łańcuch boczny powinny być najpierw usunięte zgodnie z Metodą 7, kroki  1 & 2.

  1. Zawiesić żywicę peptydową w DMF i dodać roztwór 5% wodzianu hydrazyny w DMF (20 ml/g). Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze rt.
  2. Przefiltrować żywicę przez lejek ze szkła spiekanego i przemyć żywicę najpierw DMF, a następnie TFA do oddzielnej kolby, aby usunąć nierozpuszczalny w DMF peptyd.
  3. Odparować filtraty oddzielnie do sucha na wyparce obrotowej. Wytrącić peptyd za pomocą eteru i wyizolować go przez filtrację.

Metoda 9: Rozszczepienie alkaliami w celu otrzymania wolnego kwasu3

Grupy zabezpieczające łańcuch boczny powinny być najpierw usunięte przy użyciu Metody 7 kroki 1 & 2.

  1. Pre-swell the resin in dioxane.
  2. Cool 0.1 M NaOH/ dioxane (1:3, 20 ml/g) to 0°C in an ice/water bath. Dodać żywicę peptydową i pozostawić na 15 minut w temperaturze rt.
  3. Przefiltrować żywicę za pomocą szklanego spiekanego lejka do kolby zawierającej 0,1 M HCl (5 ml/g). Kolba ta powinna być chłodzona w łaźni lodowej, aby zapobiec nagrzewaniu się, gdy roztwór podstawowy jest neutralizowany.
  4. Umyj żywicę wodą i dostosuj pH filtratu do 7,0. Liofilizować filtrat i usunąć chlorek sodu przez filtrację żelową.

Metoda 10: Rozszczepienie metanolem/DIPEA w celu otrzymania estru metylowego24

Grupy zabezpieczające łańcuch boczny powinny być najpierw usunięte przy użyciu Metody 7, kroki 1 i 2.

  1. Umieścić żywicę w czystej kolbie i dodać DMF w ilości wystarczającej do spęcznienia żywicy. Rozszczepić za pomocą DIPEA/MeOH/DMF (1:5:5, 50 ml/g).
  2. Umyć żywicę najpierw za pomocą MeOH/DMF, a następnie za pomocą TFA w oddzielnej kolbie, aby usunąć nierozpuszczalny w metanolu peptyd.
  3. Odparować filtraty oddzielnie do sucha na wyparce obrotowej. Wytrącić peptyd za pomocą eteru i wyizolować go przez filtrację.

Jeśli wydajność jest niska, powtórzyć reakcję ze świeżymi odczynnikami w temperaturze 50°C.

Metoda 11: Rozszczepianie borohydrynem w celu otrzymania alkoholu peptydowego25

Ta metoda ma zastosowanie tylko do żywic typu TG i PEGA.

Grupy zabezpieczające łańcuch boczny należy najpierw usunąć stosując Metodę 7, kroki 1 & 2.

  1. Poddać żywicę peptydylową (1,0 g) działaniu 50% aq. EtOH i pozostawić do odsączenia. Dodać NaBH4  (126 mg) w 3 ml 50% aq. EtOH i delikatnie mieszać przez 4 h.
  2. Usuń żywicę przez filtrację i przemyj 50% aq. EtOH (40 ml), aby otrzymać roztwór peptydu o pH~9.

Przed usunięciem peptydu z żywic derywatyzowanych HMBA ważne jest, aby usunąć grupy zabezpieczające łańcuchy boczne, zwłaszcza jeśli peptyd zawiera Asp lub Glu. Osiąga się to poprzez traktowanie żywicy peptydylowej 95% aq. TFA. Jeśli peptyd zawiera Arg(Mtr), resztę Arg najlepiej usunąć po odcięciu peptydu od żywicy w dodatkowym etapie przez traktowanie odczynnikiem K.

Peptydy przyłączone przez żywice sulfamylobutyrylowe, w celu wytworzenia tioestrów

Wypieranie fragmentu peptydu tiolem z alkilowanej żywicy sulfamylobutyrylowej zostało po raz pierwszy opisane przez Pessi i współpracowników26 a następnie przez innych27 - 29  (Rysunek 2).Po złożeniu łańcucha żywica jest aktywowana przez alkilowanie azotu sulfonamidowego, zwykłe traktowanie jodoacetonitrylem lub TMS-CHN2.  Aktywacja jodoacetonitrylem wytwarza bardziej reaktywny produkt pośredni, podczas gdy w przypadku TMS-CHN2 rzeczywisty proces aktywacji jest bardziej wydajny. Metody aktywacji zostały omówione w ref.30. Otrzymany N-alkiloN-acylosulfonamid jest następnie rozszczepiany przez traktowanie albo benzylomerkaptanem26 albo merkaptopropionianem etylu/tiofenolem27.Jednak połączenie aktywacji za pomocą TMS-CHN2 i wyparcia za pomocą merkaptopropionianu etylu / tiofenolu wydaje się być optymalne
(Metoda 12).Wykazano, że zastosowanie 2M LiBr w THF jako rozpuszczalnika rozszczepiającego prowadzi do znacznie lepszej wydajności tioestru peptydowego31.

Otrzymany chroniony tioester peptydowy jest następnie traktowany TFA i odpowiednimi zmiataczami w celu uzyskania zdeprotezowanego peptydu gotowego do ligacji.

synteza tioestrów

Rysunek 2:Synteza tioestrów przy użyciu żywic sulfamylobutyrylowych

Metoda 12: Ligacja tioestrów za pomocą żywic sulfamylowych

Aktywacja żywic acylosulfamylowych

  1. Zmieszać żywicę (0.1 mmol) w suchym THF w 10 ml polipropylenowej strzykawce wyposażonej w 20 mm filtr polietylenowy.
  2. Dodać 5 ml 1 M TMS-CHN2 w suchym heksanie/THF (1:1).  Zamknąć strzykawkę.
  3. Łagodnie mieszać przez 2 godziny.  Przemyć żywicę THF i użyć natychmiast lub przemyć THF, a następnie DCM i wysuszyć w próżni.

Rozszczepienie tioestru

  1. Pre-swell metylowaną żywicę w DMF przez 1 h przed użyciem.
  2. Add ethyl-3-mercaptopropionate (50 eq.) i tiofenoksyd sodu (0,5 eq.), zamknąć strzykawkę i delikatnie mieszać mieszaninę przez 24 h.
  3. Usuń żywicę przez filtrację i przemyj ją trzykrotnie DMF.
  4. Połączyć filtraty i odparować do sucha na wyparce obrotowej.  Rozetrzeć produkt eterem.
  5. Poddać pozostałość działaniu TFA/woda/TIS/fenol (88:5:2:5) przez 2 h w temperaturze rt.
  6. Dodaj roztwór rozszczepiający kroplami do 10 objętości eteru i wyizoluj produkt przez filtrację lub wirowanie przy użyciu standardowych metod.  Oczyść produkt metodą RP-HPLC.

Ligacja niezabezpieczonych fragmentów peptydów

  1. Rozpuścić tioester peptydowy (1 eq.) i N-końcowy peptyd Cys (1 eq.) w probówce z zakrętką zawierającej odgazowany 0,1 M bufor fosforanu sodu, pH 7,8. Jeśli to konieczne, roztwór może również zawierać chlorowodorek guanidyny (do 6 M), aby dodać rozpuszczanie składników peptydowych.  Końcowe stężenie peptydów powinno wynosić 2-5 mM.
  2. Dodaj tiofenol (1% objętości całego roztworu), przepłucz azotem, zamknij probówkę i energicznie mieszaj mieszaninę. Postęp reakcji można monitorować za pomocą HPLC. Reakcja zazwyczaj kończy się w ciągu 5-16 godzin.
  3. Zakwasić reakcję za pomocą TFA (0,1% objętości roztworu), liofilizować i oczyścić według standardowych procedur.

Peptydy przyłączone przez żywice hydrazynobenzoilowe

Arylowe diazeny, wytwarzane przez utlenianie arylowych hydrazyn, łatwo rozkładają się w łagodnych warunkach, dając areny i azot32. Proces ten został wykorzystany przez Millington, et al.33 jako podstawę nowego bezpiecznego łącznika, kwasu N-Fmoc-4-hydrazynobenzoesowego (Rysunek 3), który jest dostarczany dołączony do żywicy NovaGel™.

Metoda 13: Oksydacyjne rozszczepienie żywic hydrazynobenzoilowych

Do otrzymania amidów z wykorzystaniem utleniania Cu(II)33

  1. Zawiesić żywicę w czystej aminie
  2. Dodać Cu(OAc)2 (0.5 eq.) i energicznie przepuszczać powietrze przez żywicę przez 4 h.
  3. Usuń żywicę przez filtrację i przemyj ją DCM.
  4. Odparuj połączone filtraty organiczne do sucha. Ponownie rozpuścić w DCM i przemyć 1 M KHSO4, wodą i sat. NaCl.
  5. Osuszyć warstwę organiczną nad Na2SO4 i odparować do sucha.

Aby otrzymać ester lub aminę używając NBS34

  1. Zawiesić żywicę w suchym DCM
  2. Dodać NBS (2 eq.) i suchą pirydynę (2 eq.). Delikatnie mieszać przez 5 min.
  3. Usuń żywicę przez filtrację i przemyj ją suchym DCM i suchym THF.
  4. Zawieś ponownie żywicę w suchym DCM i dodaj alkohol lub aminę (5 eq.) i delikatnie mieszać przez 4 godziny.
  5. Usuń żywicę przez filtrację i przemyj DCM.
  6. Odparuj połączone filtraty do sucha.
.
zastosowania - żywice fmoc-4-hydrazynobenzoilowe

Rysunek 3:Zastosowania żywic Fmoc-4-hydrazynobenzoilowych.

Po usunięciu grupy Fmoc, związaną z żywicą grupę hydrazynową można łatwo acylować przy użyciu standardowych metod sprzęgania. Podłoże jest stabilne wobec piperydyny i TFA, ułatwiając syntezę zarówno chronionych, jak i niezabezpieczonych fragmentów peptydów.

Rozszczepienie można przeprowadzić w łagodnych warunkach utleniających przez traktowanie powietrzem i odpowiednim nukleofilem, w obecności octanu miedzi (II) i pirydyny (lub DBU), w celu dostarczenia produktów zawierających szereg modyfikacji karboksylowych, takich jak kwasy, estry i amidy.W przypadkach, gdy składnik nukleofilowy słabo rozpuszcza żywicę, do mieszaniny reakcyjnej należy dodać współrozpuszczalnik, taki jak THF lub DMF.

Alternatywnie, reakcję można przeprowadzić w dwóch etapach, najpierw generując diazen przez utlenianie NBS, a następnie rozszczepienie nukleofilem po usunięciu nadmiaru utleniacza. Zaletą tej metody jest uniknięcie zanieczyszczenia produktu miedzią. W syntezie estrów alkoholi pierwszo- i drugorzędowych, Peters & Waldmann34 stwierdzili, że aktywacja NBS daje najwyższą wydajność. Camarero i współpracownicy również wykorzystali tę metodę do przygotowania p-nitroanilidów peptydowych35 i tioestrów peptydowych 36 poprzez zastosowanie p-nitroaniliny i tioestrów aminokwasowych jako nukleofili.

Żywica ta została również wykorzystana do przygotowania cyklicznych peptydów poprzez strategię cyklicznego rozszczepiania obejmującą wewnątrzcząsteczkowy atak grupy aminowej na diazen37.

Zastosowanie żywic Fmoc-hydrazynobenzoilowych zostało niedawno poddane przeglądowi.38

Peptydy przyłączone do żywicy Dbz

.Żywice Dbz zapewniają wygodne podejście do tioestrów peptydowych i surogatów tioestrów za pomocą Fmoc SPPS39, 40  (patrz Rysunek 4).

Przed rozszczepieniem ugrupowanie Dbz wymaga konwersji do aktywowanego Nbz zgodnie z metodą 14. Reakcja jest zazwyczaj ilościowa. W przypadku żywic o wysokim obciążeniu, takich jak żywice Dawson Dbz AM, może wystąpić pewne sieciowanie ugrupowań Dbz. Z naszego doświadczenia wynika, że znacznie lepsze wyniki uzyskuje się w przypadku żywic o niskim obciążeniu, takich jak żywica Dawson Dbz NovaSyn® TGR. Obróbka żywicy Nbz za pomocą TFA uwalnia w pełni zdeprotezowany peptyd Nbz, który może być użyty bezpośrednio w reakcji NCL. Peptyd Nbz otrzymuje się jako mieszaninę regioizomerów.

synteza peptydów-tioestrów

Rysunek 4:Synteza tioestrów peptydów przy użyciu żywic Dbz.

Metoda 14: Ligacja tioestrowa żywicą Dawson Dbz AM

Synteza & Aktywacja

  1. Wydłuż łańcuch peptydowy stosując aktywację HBTU/HOBt/DIPEA, z wyjątkiem Gly, który powinien być wprowadzony przy użyciu Fmoc-Gly-OPfp/HOBt. Reszta N-końcowa musi być wprowadzona przy użyciu Boc-aminokwasu. Przemyć żywicę DMF i DCM.
  2. Dodać chloroformian p-nitrofenylu (0,5 mmola) w DCM i pozostawić do delikatnego wymieszania pod N2 przez 1 h. Przemyć żywicę DCM i dodać 0,5 M DIPEA w DMF (10 ml) i pozostawić na 30 min. Przemyć żywicę DMF i DCM.
  3. Uwolnić peptyd za pomocą TFA/woda/TIS 95:2.5:2.5 przez 3 h.

Ligacja niezabezpieczonych fragmentów peptydów

  1. Rozpuścić oczyszczony peptyd-Nbz (1 eq.) i N-końcowy peptyd-Cys (1,5 eq.) w zakręcanej probówce zawierającej odgazowany bufor do ligacji (0,2 M bufor fosforanowy, 6 M chlorowodorek guanidyny, 0,2 M kwas 4-merkaptop-fenylooctowy, 0,02 M TCEP, pH 7,0). Końcowe stężenie peptydów powinno wynosić około 2 mM.
  2. Monitoruj postęp reakcji za pomocą HPLC.
  3. Zakwasz reakcję za pomocą TFA (0,1% objętości roztworu), liofilizuj i oczyszczaj zgodnie ze standardowymi procedurami.

Aldehydy peptydowe

Istnieją trzy główne metody ich przygotowania: po pierwsze, utlenianie odpowiedniego alkoholu peptydowego41; po drugie, redukcja pochodnej peptydowego kwasu karboksylowego, takiej jak ester Weinreba42, 43 (zob.(patrz Metoda 15); wreszcie, synteza stopniowa lub synteza fragmentów z użyciem zamaskowanego wstępnie uformowanego aldehydu44 (patrz Metoda 16).

Peptydy przyłączone do żywicy Weinreba

Redukcja N-metoksy-N-metyloamidów (amidów Weinreba) za pomocą LiAlH4 lub DIBAL jest dobrze znaną strategią wytwarzania peptydów i a-aminoaldehydów42. Fehrentz i współpracownicy43 dostosowali tę metodologię do zastosowania w SPOS, poprzez proste urządzenie zastępujące grupę N- metylową amidu Weinreba łącznikiem, który umożliwia przyłączenie metoksyaminy do stałego nośnika.

Z uwagi na utrudniony charakter aminy drugorzędowej związanej z żywicą, do dodania pierwszej reszty należy użyć HOAt/DIPCDI lub HATU/DIPEA (Metoda 4). Otrzymany nośnik jest stabilny w warunkach Fmoc i Boc SPPS. Po redukcji LiAlH4, Fehrentz, et al. donieśli o otrzymaniu aldehydów peptydowych z wydajnością 30-40%.

Metoda 15: Redukcyjne rozszczepienie amidów Weinreba

Aby zapobiec reakcjom ubocznym z niektórymi funkcjonalnościami łańcucha bocznego aminokwasów, zwykle zaleca się pozostawienie wszystkich grup ochronnych na miejscu; wyjątkiem jest sytuacja, gdy peptyd zawiera Asp i Glu, ponieważ nawet estry t-Bu tych reszt są redukowane przez LiAlH4. W przypadku peptydów, N-końcowa grupa aminowa powinna być zablokowana grupą Boc; grupa Fmoc nie jest stabilna w tych warunkach.

  1. Pre-swell resin (0.1 mmole) in dry THF for 1 h before use, in a round-bottomed flask equipped with a magnetic stirrer.
  2. Przepłukać kolbę argonem, a następnie zamknąć i umieścić w łaźni lodowej.
  3. Dodać 1 M LiAlH4 w THF (0,5 ml, 0,5 mmolaa) za pomocą strzykawki. Delikatnie mieszać przez 40 min.
  4. Rozcieńczyć mieszaninę THF i dodać nasycony KHSO4 (0,5 ml) i winian K, Na (0,3 ml). Delikatnie mieszać mieszaninę przez 30 minut i pozostawić do ogrzania do temperatury rt.
  5. Usuń żywicę przez filtrację i przemyj ją DCM.
  6. Osusz połączone filtraty organiczne bezwodnym MgSO4 i odparuj do sucha.

aDla długich peptydów ilość LiAlH4 może wymagać zwiększenia; odwrotnie, dla małych cząsteczek organicznych ilość ta może być znacznie zmniejszona.

Metoda 16: Rozszczepianie żywicy H-Thr-Gly-NovaSyn® TG

Rozszczepianie z żywicy i deprotekcja łańcucha bocznego jest przeprowadzana w dwóch etapach.

  1. Usuwanie grup zabezpieczających łańcuchy boczne za pomocą bezwodnego TFA.
  2. Usuwanie aldehydu peptydowego z żywicy za pomocą AcOH/woda/DCM/MeOH (10:5:63:21) (3 x 30 min).

Linia produktów Novabiochem® oferuje obecnie żywicę H-Thr-Gly-NovaSyn® TG wstępnie załadowaną aldehydami Arg, Asp, Leu, Phe i Val.

Post-cleavage work-up

NIE WYRZUCAĆ nośnika żywicznego ani eteru do czasu zakończenia analizy peptydów. Oba mogą być przechowywane pod azotem lub argonem w temperaturze 4°C, aby zapobiec utlenianiu.

Otrącanie eterem

Większość protokołów rozszczepiania obejmuje wytrącanie surowego rozszczepionego peptydu przy użyciu zimnego eteru etylowego. Poniżej przedstawiono ogólne procedury postępowania po rozszczepieniu.

Metoda 17: Obróbka po rozszczepieniu

Izolację peptydów i obróbkę można przeprowadzić przez wytrącanie (1) lub wirowanie (2). W przypadku peptydów rozpuszczalnych w wodzie można zastosować metodę opisaną w krokach 3-6.

  1. Precypitacja: Przefiltrować wytrącony peptyd przez utwardzoną bibułę filtracyjną w lejku Hirscha pod lekką próżnią. Przemyć osad zimnym eterem, rozpuścić peptyd w odpowiednim buforze wodnym i liofilizować.
  2. Wirowanie: Dodać niewielką objętość eteru metylobutylowego do pozostałości i dokładnie rozcierać aż do uzyskania wolnej zawiesiny. Przenieść zawiesinę do czystej probówki wirówkowej, uszczelnić i odwirować. Ważne jest, aby do tego procesu używać wirówki beziskrowej. Ostrożnie zdekantować eter z probówki. W razie potrzeby powtórzyć płukanie eterem. Rozpuścić pozostałą substancję stałą w odpowiednim buforze wodnym i liofilizować.
  3. Peptydy rozpuszczalne w wodzie: Po wytrąceniu dodać wodę do pozostałości i przenieść mieszaninę do rozdzielacza. Może być konieczne dodanie niewielkiej ilości AcOH w celu ułatwienia rozpuszczania.
  4. Dobrze wstrząsnąć zakorkowanym lejkiem. Zwolnij korek i pozwól dwóm warstwom rozdzielić się na stojąco. Wyizoluj dolną (wodną) warstwę.
  5. Dodaj więcej wody do lejka i powtórz krok 4 trzy razy. Usuń górną (eteryczną) warstwę i przechowuj ją w czystej kolbie. Dodaj niewielką ilość świeżego eteru dietylowego i powtórz krok 4 dwa lub trzy razy, za każdym razem usuwając warstwę eteryczną i zwracając warstwę wodną do rozdzielacza. Zebrać warstwę wodną do czystej kolby i liofilizować.

W metodach opisanych powyżej, wydajność peptydu może być często zwiększona, jeśli TFA zostanie najpierw usunięty za pomocą wyparki obrotowej (wyposażonej w zimny palec CO2/aceton, pompę olejową i pułapkę kwasową) przed etapem wytrącania eteru. W większości przypadków, po dodaniu eteru, peptyd przylega do ścianek kolby reakcyjnej, umożliwiając szybkie i łatwe usunięcie zmiataczy poprzez wielokrotne przemywanie eterem. Uwaga: mieszaniny rozszczepiające zawierające TFMSA i HBF4 nie powinny być odparowywane do sucha.

Ponieważ peptydy przygotowane przy użyciu metody rozszczepiania o niskiej i wysokiej zawartości HF mogą zawierać rozpuszczalne w wodzie pochodne sulfonowe, zaleca się ich usunięcie bezpośrednio przed liofilizacją, ponieważ w warunkach obojętnych lub lekko zasadowych mogą one powodować alkilację reszt metioniny i cysteiny.

Materiały
Loading

Referencje

1.
KING DS, FIELDS CG, FIELDS GB. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. 36(3):255-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1990.tb00976.x
2.
Albericio F, Kneib-Cordonier N, Biancalana S, Gera L, Masada RI, Hudson D, Barany G. 1990. Preparation and application of the 5-(4-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)-valeric acid (PAL) handle for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides under mild conditions. J. Org. Chem.. 55(12):3730-3743. https://doi.org/10.1021/jo00299a011
3.
Atherton E, Sheppard CR. 1989. Solid phase peptide synthesis: a practical approach. IRL Press, Oxford:
4.
Sieber P, Riniker B. 1987. Protection of histidine in peptide synthesis: A Reassessment of the trityl group. Tetrahedron Letters. 28(48):6031-6034. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96856-4
5.
Rivier EJ, Marshall RG. Peptides, Chemistry, Structure & Biology, Proc. 11th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp 950:
6.
Smith AJ, Rivier EJ. 1992. Peptides, Chemistry, Structure & Biology, Proc. 12th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 537:
7.
White P. 1991. Novabiochem Satellite Meeting. Solid Phase Synthesis, 2nd International Meeting; Canterbury
8.
CHOI H, ALDRICH J. Comparison of methods for the Fmoc solid-phase synthesis and cleavage of a peptide containing both tryptophan and arginine. 42(1):58-63. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00350.x
9.
Roger E. 1994. Innovations & Perspectives in Solid Phase Synthesis. 3rd International Symposium; Birmingham pp. 251.: Mayflower Worldwide Ltd.
10.
Fields CG, Fields GB. 1993. Minimization of tryptophan alkylation following 9-fluorenylmethoxycarbonyl solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 34(42):6661-6664. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)61669-6
11.
BECK-SICKINGER AG, SCHNORRENBERG G, METZGER J, JUNG G. Sulfonation of arginine residues as side reaction in Fmoc-peptide synthesis. 38(1):25-31. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb01405.x
12.
JAEGER E, REMMER HA, JUNG G, METZGER J, OBERTHÜR W, RÜCKNAGEL KP, SCHÄFER W, SONNENBICHLER J, ZETL I. 1993. Nebenreaktionen bei Peptidsynthesen, V. O-Sulfonierung von Serin und Threonin während der Abspaltung der Pmc- und Mtr-Schutzgruppen von Argininresten bei Fmoc-Festphasen-Synthesen. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 374(1-6):349-362. https://doi.org/10.1515/bchm3.1993.374.1-6.349
13.
Atherton E, Sheppard RC, Ward P. 1985. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2065. https://doi.org/10.1039/p19850002065
14.
Pearson DA, Blanchette M, Baker ML, Guindon CA. 1989. Trialkylsilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 30(21):2739-2742. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99113-5
15.
Sole NA, Barany G. 1992. Optimization of solid-phase synthesis of [Ala8]-dynorphin A. J. Org. Chem.. 57(20):5399-5403. https://doi.org/10.1021/jo00046a022
16.
Guol L, FUNAKOSHI S, FUJII N, YAJIMA H. 1988. Studies on peptides. CLXV. Combination of a new amide-precursor reagent and trimethylsilyl bromide deprotection for the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-based solid-phase synthesis of chicken antral peptide.. Chem. Pharm. Bull.. 36(12):4989-4992. https://doi.org/10.1248/cpb.36.4989
17.
Available from: https://www.febs.org/
18.
Rink H. 1987. Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a trialkoxy-diphenyl-methylester resin.. Tetrahedron Letters. 28(33):3787-3790. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96384-6
19.
Giralt E, Andreu D. 1991. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 419:
20.
Barlos K, Gatos D, Kallitsis J, Papaphotiu G, Sotiriu P, Wenqing Y, Schäfer W. 1989. Darstellung geschützter peptid-fragmente unter einsatz substituierter triphenylmethyl-harze. Tetrahedron Letters. 30(30):3943-3946. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99290-6
21.
Barlos K, Gatos D, Kapolos S, Papaphotiu G, Schäfer W, Wenqing Y. 1989. Veresterung von partiell geschützten peptid-fragmenten mit harzen. Einsatz von 2-chlortritylchlorid zur synthese von Leu15 -gastrin I. Tetrahedron Letters. 30(30):3947-3950. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99291-8
22.
Barlos K, et al. a. 1991. 2-cholorotrityl chloride resin. Int J Peptide Protein Res. 37513-520.
23.
Girald E, Andreu D. 1991. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 131:
24.
Hodges SR, Smith AJ. 1994. Peptides, Chemistry, Structure & Biology. Proc. 13th American Peptide Symposium; ESCOM, Leiden pp. 157:
25.
Sieber P. 1987. A new acid-labile anchor group for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides by the Fmoc method.. Tetrahedron Letters. 28(19):2107-2110. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96055-6
26.
Smith AJ, Rivie EJ. 1992. Peptides, Chemistry & Biology, Proc. 12th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 525:
27.
Chan W, White P. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. 222. Oxford University Press, Oxford: pp. 218.
28.
Stewart MJ, Young DJ. 1984. Solid phase peptide synthesis. 2nd edition. Pierce Chemical Company, Rockford: pp. 91.
29.
Mellor S, et a. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford University Press, Oxford: pp. 147-148.
30.
Ingenito R, Bianchi E, Fattori D, Pessi A. 1999. Solid Phase Synthesis of Peptide C-Terminal Thioesters by Fmoc/t-Bu Chemistry. J. Am. Chem. Soc.. 121(49):11369-11374. https://doi.org/10.1021/ja992668n
31.
Shin Y, Winans KA, Backes BJ, Kent SBH, Ellman JA, Bertozzi CR. 1999. Fmoc-Based Synthesis of Peptide-?Thioesters:  Application to the Total Chemical Synthesis of a Glycoprotein by Native Chemical Ligation. J. Am. Chem. Soc.. 121(50):11684-11689. https://doi.org/10.1021/ja992881j
32.
Biancalana S, et. a. 2001. Fmoc chemistry compatible thio-ligation assembly of proteins. Lett Pept Sci. 7291-297.
33.
Escher SE, Klüver E, Adermann K. 2001. 8(6):349-357. https://doi.org/10.1023/a:1016286204570
34.
Heidler P, Link A. 2005. N-Acyl-N-alkyl-sulfonamide anchors derived from Kenner?s safety-catch linker: powerful tools in bioorganic and medicinal chemistry. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 13(3):585-599. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2004.10.045
35.
Quaderer R, Hilvert D. 2001. Improved Synthesis of C-Terminal Peptide Thioesters on ?Safety-Catch? Resins Using LiBr/THF. Org. Lett.. 3(20):3181-3184. https://doi.org/10.1021/ol016492h
36.
Patai S. 1975. The Chemistry of the hydrazo, azo and azoxy group Part 1. pp. 542: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester.
37.
Millington CR, Quarrell R, Lowe G. 1998. Aryl hydrazides as linkers for solid phase synthesis which are cleavable under mild oxidative conditions. Tetrahedron Letters. 39(39):7201-7204. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(98)01543-3
38.
Peters C, Waldmann H. 2003. Solid-Phase Synthesis of Peptide Esters Employing the Hydrazide Linker. J. Org. Chem.. 68(15):6053-6055. https://doi.org/10.1021/jo034164k
39.
Kwon Y, Welsh K, Mitchell AR, Camarero JA. 2004. Preparation of Peptidep-Nitroanilides Using an Aryl Hydrazine Resin. Org. Lett.. 6(21):3801-3804. https://doi.org/10.1021/ol048417n
40.
Camarero JA, Hackel BJ, de Yoreo JJ, Mitchell AR. 2004. Fmoc-Based Synthesis of Peptide ?-Thioesters Using an Aryl Hydrazine Support?. J. Org. Chem.. 69(12):4145-4151. https://doi.org/10.1021/jo040140h
41.
Rosenbaum C, Waldmann H. 2001. Solid phase synthesis of cyclic peptides by oxidative cyclative cleavage of an aryl hydrazide linker?synthesis of stylostatin 1. Tetrahedron Letters. 42(33):5677-5680. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)01075-9
42.
Woo Y, Mitchell AR, Camarero JA. 2007. The Use of Aryl Hydrazide Linkers for the Solid Phase Synthesis of Chemically Modified Peptides. Int J Pept Res Ther. 13(1-2):181-190. https://doi.org/10.1007/s10989-006-9064-x
43.
Blanco-Canosa J, Dawson P. 2008. An Efficient Fmoc-SPPS Approach for the Generation of Thioester Peptide Precursors for Use in Native Chemical Ligation. Angew. Chem. Int. Ed.. 47(36):6851-6855. https://doi.org/10.1002/anie.200705471
44.
Harpaz Z, Siman P, Kumar KSA, Brik A. Protein Synthesis Assisted by Native Chemical Ligation at Leucine. Chem. Eur. J. of Chem. Bio.. 11(9):1232-1235. https://doi.org/10.1002/cbic.201000168
45.
Pentelute BL, Barker AP, Janowiak BE, Kent SBH, Collier RJ. 2010. A Semisynthesis Platform for Investigating Structure?Function Relationships in the N-Terminal Domain of the Anthrax Lethal Factor. ACS Chem. Biol.. 5(4):359-364. https://doi.org/10.1021/cb100003r
46.
Tiefenbrunn TK, Blanco-Canosa J, Dawson PE. Alternative chemistries for the synthesis of thrombospondin-1 type 1 repeats. Biopolymers. 94(4):405-413. https://doi.org/10.1002/bip.21486
47.
Woo J, Sigeizumi S, Yamaguchi K, Sugimoto K, Kobori T, Tsuji T, Kondo K. 1995. Peptidyl aldehyde derivatives as potent and selective inhibitors of cathepsin L. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 5(14):1501-1504. https://doi.org/10.1016/0960-894x(95)00236-m
48.
Nahm S, Weinreb SM. 1981. N-methoxy-n-methylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Letters. 22(39):3815-3818. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)91316-4
49.
Fehrentz J, Paris M, Heitz A, Velek J, Liu C, Winternitz F, Martinez J. 1995. Improved solid phase synthesis of C-terminal peptide aldehydes. Tetrahedron Letters. 36(43):7871-7874. https://doi.org/10.1016/0040-4039(95)01646-y
50.
2000. N. J. Ede, et al. J. Pept. Sci., 6, 11.. https://doi.org/10.1002/(SICI)1099-1387(200001)6:1<11::AID-PSC229>3.0.CO;2-%23
Powiązane protokoły
Powiązane kategorie produktów
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?