Wpływ DMSO i techniki zamrażania na rozwój procesu kriokonserwacji o wysokiej gęstości komórek dla bioprocesów wyższego szczebla

Czytaj o

• Zastosowanie DMSO w kriokonserwacji: HCDC vs. Traditional Cell Banking
• Wpływ stężenia DMSO na HCDC
• Technika zamrażania w kriokonserwacji: HCDC vs. tradycyjny bank komórek

Rozwój linii nasiennej dla bioprocesów wyższego szczebla obejmuje optymalizację wielu warunków - pożywki, paszy, początkowej gęstości inokulum itp. Integracja

Kriokonserwacja o wysokiej gęstości komórek (HCDC) w linii nasiennej oznacza również uwzględnienie takich parametrów, jak wybór krioprotektantu i techniki zamrażania.

W HCDC komórki są zamrażane z wysoką gęstością i w większych objętościach w porównaniu do tradycyjnego procesu ekspansji. Ostatecznym celem stosowania HCDC jest intensyfikacja procesu wyższego szczebla w celu poprawy wydajności i produktywności, skrócenia czasu i zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia (zobacz inne zalety HCDC tutaj).

Oceniliśmy, w jaki sposób techniki dimetylosulfotlenku i zamrażania wpływają na gęstość żywotnych komórek i produkcję miana w HCDC zintensyfikowanym procesie nasiennym. Chociaż proces HCDC powinien być dostosowany do używanej linii komórkowej, poniższe informacje stanowią podstawę do opracowania warunków specyficznych dla linii komórkowej.

Zastosowanie DMSO w kriokonserwacji: HCDC a tradycyjna bankowość komórkowa

DMSO jest zwykle dodawane do pożywki używanej do zamrażania komórek w stężeniu od 5-10%, aby chronić je przed trudnymi warunkami.

Bankowość komórkowa zwykle wykorzystuje fiolki o pojemności 2 ml, które są napełniane za pomocą pipety w stosunkowo szybkim procesie. Oznacza to, że komórki mają ograniczoną ekspozycję na DMSO przed zamrożeniem. W przypadku HCDC do zamrażania komórek stosuje się objętości w zakresie od 60 do 250 ml, w związku z czym proces napełniania trwa dłużej. Komórki są zatem narażone na działanie DMSO przez dłuższy czas, potencjalnie zwiększając ryzyko uszkodzenia przez samo DMSO.

Aby zaszczepić kolejne naczynie bioreaktora, cała objętość worka HCDC jest rozmrażana i dodawana, w tym DMSO. Niewielkie objętości stosowane w konwencjonalnym bankowaniu zazwyczaj nie stanowią problemu, ponieważ współczynnik rozcieńczenia jest bardzo wysoki. Dodatkowo, małe fiolki można odwirować w celu usunięcia pożywki zawierającej DMSO, a następnie ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce. Proces ten minimalizuje obecność DMSO w procesie poprzedzającym, który może wpływać na zdrowie i wzrost komórek, a także na atrybuty jakości leku. W przypadku HCDC nie ma możliwości odwirowania komórek, ponieważ są one zamrożone w workach, a objętość dodana do bioreaktora skutkuje znacznie wyższym współczynnikiem rozcieńczenia.

Wpływ stężenia DMSO na HCDC

Przeprowadziliśmy serię badań w celu zidentyfikowania optymalnych parametrów stosowania DMSO w procesie HCDC. Oceniono następujące parametry:

• Stężenia DMSO od 0 do 15 procent
• Czasy ekspozycji komórek zawieszonych w pożywce do kriokonserwacji DMSO od braku dodatkowej inkubacji do dwóch godzin dodatkowego czasu inkubacji
• Temperatury, w których komórki miały kontakt z DMSO
• Różne linie komórkowe CHO-K1, DG44, CHO-S i CHOZN^®, naszej zastrzeżonej platformy linii komórkowych

Wpływ stężenia DMSO i czasu inkubacji na linię komórkową CHO-S

.Zaobserwowaliśmy, jak te parametry wpływają na gęstość żywotnych komórek, żywotność i końcową produkcję IgG różnych linii komórkowych CHO po wystawieniu na działanie pożywki do hodowli komórkowej zawierającej DMSO (Rysunek 1). Klon CHO-S użyty w tym badaniu wykazał najwyższą wrażliwość i odchylenie w porównaniu z innymi klonami (CHO-K1, CHO-DG44, CHOZN^®; dane nie pokazane). Ogólnie rzecz biorąc, najbardziej stabilne warunki zaobserwowano przy stężeniu DMSO wynoszącym 7,5% wśród wszystkich linii komórkowych, a nawet w przypadku bardziej wrażliwego klonu CHO-S wpływ techniki zamrażania na gęstość komórek był minimalny.

Rysunek 1. Wpływ stężenia DMSO i czasu inkubacji na gęstość żywotnych komórek, żywotność i stężenie IgG.

Stężenie DMSO w bioreaktorze

Używając jednej linii komórkowej, zaszczepiliśmy probówki zawiesiną komórkową zawierającą DMSO w stężeniach od 0 do 10 procent. Żywotność zmniejszyła się w czasie przy stężeniach powyżej 1%, gdy komórki są w kontakcie z DMSO (Rysunek 2A).

Jeśli chodzi o próg toksyczności DMSO, stwierdziliśmy, że końcowe stężenie DMSO w bioreaktorze powinno wynosić około 0,5%. Przy 7,5% DMSO, 150 ml cryobag dodany do bioreaktora o pojemności 2,2 litra odpowiada pożądanemu rozcieńczeniu 1:15. Ponieważ rozmiar bioreaktora, który można zaszczepić workiem o pojemności 150 ml, przekracza 2,2 litra, końcowe stężenie DMSO w naczyniu hodowlanym jest znikome.

Rysunek 2. Wpływ stężenia DMSO (A) i progu toksyczności (B) na procentową żywotność i gęstość żywotnych komórek. Wstępne schłodzenie zawiesiny komórek przed napełnieniem worka może być korzystne, ponieważ zawiesina komórek wychodząca z bioreaktora ma temperaturę 37 °C, co może zwiększyć wpływ DMSO na wrażliwe komórki.

Techniki zamrażania do kriokonserwacji: HCDC vs. tradycyjny bank komórek

Standardowe protokoły zamrażania komórek zalecają szybkość zamrażania około -1 do -2 °C/min, aby zapobiec uszkodzeniu komórek. Chociaż podejście to jest łatwe do wykonania w przypadku małych fiolek z komórkami, jest ono niepraktyczne w przypadku dużej liczby kriobagów o większej objętości. W związku z tym oceniono możliwy wpływ niekontrolowanego zamrażania i czy konieczne jest kontrolowanie procesu.

Metody zamrażania

Użyliśmy dwóch linii komórkowych (CHO-S i CHOZN^®) i zamroziliśmy je przy użyciu trzech różnych technik: (1) bezpośrednie umieszczenie w zamrażarce o temperaturze -80 °C, (2) zamrożenie w zamrażarce o kontrolowanej szybkości oraz (3) umieszczenie w pojemniku CoolCell^® (Corning). Technika zamrażania nie miała wpływu na żadną z linii komórkowych dla żadnego z mierzonych parametrów krytycznych (Rysunek 3).

Chociaż nie było wpływu na dwie linie komórkowe, ważne jest, aby ocenić technikę zamrażania dla poszczególnych linii komórkowych.

Rysunek 3. Wpływ różnych technik zamrażania na gęstość żywotnych komórek, żywotność komórek i produkcję IgG z linii komórkowych CHO-S i CHOZN^® zamrażanych różnymi technikami.

Użycie HCDC jest sprawdzoną strategią intensyfikacji przepływu pracy. Tutaj ustaliliśmy wytyczne dotyczące zalecanego stężenia DMSO i procesu zamrażania dla procesu HCDC. Chociaż każda linia komórkowa może reagować na proces HCDC w nieco inny sposób, wytyczne te stanowią podstawę do opracowania warunków specyficznych dla linii komórkowej.