Synteza i analiza HILIC/MS acylokarnityn

Rudolf Köhling, Markus Obkirche

Reporter US Volume 34.2

Wprowadzenie

L-karnityna została odkryta na początku ubiegłego wieku i odgrywa ważną rolę w szlakach metabolicznych kwasów tłuszczowych. Działa jako nośnik długołańcuchowych grup acylowych z aktywowanych kwasów tłuszczowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną do macierzy mitochondrialnej, gdzie ulegają β-oksydacji do acetylo-CoA w celu uzyskania użytecznej energii poprzez cykl kwasu cytrynowego.¹ Powstała cząsteczka "acylo-L-karnityny" jest pokazana na Rysunku 1. Szereg chorób spowodowanych defektami transportu mitochondrialnego charakteryzuje się specyficznymi dysfunkcjami metabolicznymi i zależy od fizjologicznej roli dotkniętego nośnika w metabolizmie pośrednim.² Dlatego funkcje i role acylo-L-karnityny w różnych tkankach, takich jak mózg, serce i mięśnie, nadal przyciągają wiele zainteresowania.^3-6

Rysunek 1. Struktura macierzysta acylo-L-karnityny R reprezentuje łańcuchy acylowe o różnej długości pochodzące z transportowanego kwasu tłuszczowego.

Wymagania analityczne

Programy badań przesiewowych noworodków wykrywają możliwe do leczenia zaburzenia u niemowląt, zanim staną się one objawowe. Chromatografia cieczowa-tandemowa spektrometria mas (LC/MS/MS) znacznie zwiększyła możliwości badań przesiewowych w programach badań przesiewowych noworodków poprzez monitorowanie poziomów acylokarnityn w celu wykrycia możliwych do leczenia zaburzeń u niemowląt przed pojawieniem się objawów. LC/MS/MS może wykryć kilka zaburzeń za pomocą jednego wstrzyknięcia, co jest ważne w laboratoriach o dużej przepustowości. Pomiar różnych acylokarnityn może być wykorzystany do wykrycia ponad 40 różnych wrodzonych błędów metabolizmu, których wybór przedstawiono w Tabeli 1.

Czyste i stabilne wzorce metabolitów, jak również solidne i czułe metody ich analizy są warunkami wstępnymi do badania funkcji zdrowych i chorych komórek biologicznych na poziomie szlaków molekularnych. Fenotypowanie metaboliczne człowieka w odniesieniu do diagnostyki klinicznej, prognozowania i epidemiologii jest zatem jednym z najszerzej stosowanych obszarów rozwoju medycyny precyzyjnej.⁷ W celu opracowania nowych metod analitycznych należy ustalić metodologie syntetyczne dla wymaganych metabolitów.⁸

Tabela 1.Wybrane acylo-L-karnityny dla zależności genotyp-fenotyp we wrodzonych błędach metabolizmu

Genotypy chromosomowe	Gene/Locus	MIM No.*	Fenotyp	Numer MIM *
3p21.31	SLC25A20	613698	Niedobór translokazy karnityna-acylokarnityna (CACTD)	212138
1p32.3	CPT2	600650	Podatność na ostrą encefalopatię wywołaną infekcją (IIAE4)	614212
2p23.3	HADHA	600890	Niedobór dehydrogenazy długołańcuchowego 3-hydroksyacylo-CoA	609016
11q25	ACAD8	604773	Niedobór dehydrogenazy izobutyrylo-CoA	611283
1p31.1	ACADM	607008	Deficyt dehydrogenazy średniołańcuchowych acylo-CoA (ACADMD)	201450
8q24.3	SLC52A2	607882	Zespół Browna-Vialetto-Van Laere'a 2 (BVVLS2)	614707
4q32.1	ETFDH	231675	Niedobór dehydrogenazy wielu acylo-CoA IIC (MADD) Kwasica glutarowa	231680
19p13.2	CD320	606475	Kwasomocz metylomalonowy spowodowany defektem receptora transkobalaminy	613646
4q25	HADHSC	601609	Rodzinna hiperglikemia hiperinsulinemiczna 4	609975
11q13.3	CPT1A	600528	Wątrobowy niedobór palmitoilotransferazy I karnityny, typ 1A	255120
10q26.13	ACADSB	600301	Niedobór dehydrogenazy 2-metylobutyrylo-CoA, 2-metylobutyryloglicynuria	610006

Synteza acylo-L-karnityny

Rozszerzenie portfolio wzorców acylo-L-karnityny firmy Sigma-Aldrich zostało pomyślnie osiągnięte dzięki uogólnionemu podejściu syntetycznemu. Chlorowodorek L-karnityny dodano do mieszaniny odpowiedniego kwasu karboksylowego i niewielkiego nadmiaru molowego chlorku kwasu. Mieszaninę reakcyjną utrzymywano w podwyższonej temperaturze, aż analiza TLC wykazała optymalny stosunek odpowiedniego produktu do materiału wyjściowego i produktów ubocznych.⁹ Jeśli odpowiedni chlorek kwasu nie był dostępny, kwas karboksylowy poddawano reakcji w pierwszym etapie z chlorkiem tionylu, a następnie kolejno dodawano karnitynę.

Aby uniknąć przeciwjonów (np. chlorków), które są niepożądane w niektórych zastosowaniach, wszystkie acylo-L-karnityny zostały przekształcone w ich sole wewnętrzne poprzez późniejszą obróbkę na słabo zasadowym wymieniaczu anionowym.¹⁰ Po wytrąceniu surowego produktu wymagana była chromatografia kolumnowa w celu usunięcia wszelkich śladów karnityny i produktów ubocznych.

Analiza LC/MS acylo-L-karnityn

Ponieważ detekcja UV acylokarnityn jest bardzo niewrażliwa, wymagana jest metoda umożliwiająca rozdział, identyfikację i kwantyfikację za pomocą detektorów uzupełniających, takich jak spektrometria mas (MS) lub detekcja naładowanego aerozolu (CAD). Wykrywanie za pomocą MS zapewnia wymaganą czułość, a bezpośrednia infuzja może być wystarczająca do analizy szeregu różnych acylo-L-karnityn. Jednak w przypadku bardziej szczegółowej analizy i pomiaru izomerów acylokarnityny, które są blisko spokrewnione, ważne jest oddzielenie za pomocą chromatografii cieczowej przed wykryciem.^11,12 Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas została uznana za skuteczną i solidną metodologię analizy acylo-L-karnityn, a chromatografia cieczowa z interakcją hydrofilową (HILIC) w celu oddzielenia wolnej karnityny i acylokarnityn jest szybka i nie wymaga derywatyzacji.^13-15 W tym badaniu zbadano chromatografię w trybie HILIC przy użyciu kolumny Ascentis^® Express OH5 z gradientem acetonitrylu w 50 mm octanie amonu. Instrument LC i MS oraz ustawienia przedstawiono w Tabeli 2 i Tabeli 3. Końcowe warunki chromatograficzne przedstawiono na Rysunku 2.

Tabela 2.Urządzenie i ustawienia LC/MS

Urządzenie LC	Dionex® UltiMate® 3000 RSLC
Czas wyrównania	10 min
Urządzenie MS	Bruker micrOTOF-Q II™
MS Scan	Czas od 0 do 20, ESI(+)
Przepływ gazu	-
Temperatury	-
Suchy gaz	9 L/h, 250 °C
Napięcia	-
Kapilara (kV)	4.5

Tabela 3.Analiza LC-MS wybranych acylo-L-karnityn

Analyte	Mol. Masa	Max m/z
Stearoyl-L-Carnitine	427.66	428.371
Palmitoilo-L-karnityna	399.61	400.3401
Myristoyl-L-Carnitine	371.4	372.3091
Lauroilo-L-karnityna	343.5	344.2786
Decanoyl-L-Carnitine	315.45	316.2471
Octanoyl-L-Carnitine	287.4	288.2156
Hexanoyl-L-Carnitine	259.3	260.1846
Izowalerylo-L-karnityna	245.32	246.17
2-Methylbutyryl-L-Carnitine	245.32	246.17
Isobutyryl-L-Karnityna	231.29	232.1529
Butyryl-L-karnityna	231.29	232.1529
Propionylo-L-karnityna	217.26	218.1375
Acetyl-L-Carnitine HCl	203.6	204.1228
L-Karnityna	161.2	162.1107

Rysunek 2. Analiza LC/MS dwunastu acylo-L-karnityn w urządzeniu Ascentis Express OH5 (tryb HILIC)

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Referencje

1. Kerner J, Hoppel C. 2000. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1486(1):1-17. https://doi.org/10.1016/s1388-1981(00)00044-5

2. Palmieri F. 2008. Diseases caused by defects of mitochondrial carriers: A review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1777(7-8):564-578. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2008.03.008

3. Pekala J, Patkowska-Sokola B, Bodkowski R, Jamroz D, Nowakowski P, Lochynski S, Librowski T. 2011. L-Carnitine - Metabolic Functions and Meaning in Humans Life. CDM. 12(7):667-678. https://doi.org/10.2174/138920011796504536

4. Jones LL, McDonald DA, Borum PR. 2010. Acylcarnitines: Role in brain. Progress in Lipid Research. 49(1):61-75. https://doi.org/10.1016/j.plipres.2009.08.004

5. Calvani M, Reda E, Arrigoni-Martelli E. 2000. Regulation by carnitine of myocardial fatty acid and carbohydrate metabolism under normal and pathological conditions. Basic Research in Cardiology. 95(2):75-83. https://doi.org/10.1007/s003950050167

6. Muoio D, Neufer P. 2012. Lipid-Induced Mitochondrial Stress and Insulin Action in Muscle. Cell Metabolism. 15(5):595-605. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2012.04.010

7. Lindon JC, Nicholson JK, Holmes E. 2011. The Handbook of Metabonomics and Metabolomics. Elsevier.

8. Wohlgemuth R. 2009. Tools and ingredients for the biocatalytic synthesis of metabolites. Biotechnology Journal. 4(9):1253-1265. https://doi.org/10.1002/biot.200900002

9. Ziegler HJ, Bruckner P, Binon F. 1967. O-acylation f dl-carnitine chloride. J. Org. Chem.. 32(12):3989-3991. https://doi.org/10.1021/jo01287a057

10. STRACK E, MÜLLER DM. 1970. Darstellung vonO-Acyl-carnitinen. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 351(1):95-98. https://doi.org/10.1515/bchm2.1970.351.1.95

11. Mansour FR, Wei W, Danielson ND. 2013. Separation of carnitine and acylcarnitines in biological samples: a review. Biomed. Chromatogr.. 27(10):1339-1353. https://doi.org/10.1002/bmc.2995

12. Ozben T. 2013. Expanded newborn screening and confirmatory follow-up testing for inborn errors of metabolism detected by tandem mass spectrometry. 51(1): https://doi.org/10.1515/cclm-2012-0472

13. Lehotay D, Hall P, Lepage J, Eichhorst J, Etter M, Greenberg C. 2011. LC?MS/MS progress in newborn screening. Clinical Biochemistry. 44(1):21-31. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2010.08.007

14. Peng M, Fang X, Huang Y, Cai Y, Liang C, Lin R, Liu L. 2013. Separation and identification of underivatized plasma acylcarnitine isomers using liquid chromatography?tandem mass spectrometry for the differential diagnosis of organic acidemias and fatty acid oxidation defects. Journal of Chromatography A. 131997-106. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2013.10.036

15. Peng M, Liu L, Jiang M, Liang C, Zhao X, Cai Y, Sheng H, Ou Z, Luo H. 2013. Measurement of free carnitine and acylcarnitines in plasma by HILIC-ESI-MS/MS without derivatization. Journal of Chromatography B. 93212-18. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2013.05.028

16. McKusick VA. 1998. Mendelian Inheritance in Man: A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. 12th Edition. Johns Hopkins University Press.