Oznaczanie enancjomerów kwasu L- i D-mlekowego metodą HPLC/MS/MS
H. Henry1, N. Marmy Conus2, P. Steenhout2, A. Benguin1, O. Boulat1
1University of Lausanne, 2Nestac Ltd.
Wprowadzenie
Niniejszy artykuł stanowi podsumowanie pracy H. Henry'ego i współpracowników z Clinical Chemistry Laboratory, Centre Hospitalier Universiaire Vaudois, University of Lausanne, CH-1011 Lausanne, Szwajcaria1. Oznaczanie enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego (Rysunek 1) i ich późniejsza kwantyfikacja ma kluczowe znaczenie u niemowląt, ponieważ znaczny nadmiar produkcji D-kwasu mlekowego może prowadzić do kwasicy metabolicznej skutkującej poważnymi objawami neurologicznymi, jeśli nie jest leczona. W związku z tym kwas D-mlekowy może być markerem klinicznym do diagnozowania tych chorób. W związku z tym oznaczanie poziomu kwasu mlekowego, a zwłaszcza kwasu D-mlekowego, ma ogromne znaczenie w diagnostyce klinicznej. Istnieje potrzeba opracowania niezawodnej i selektywnej metody wykrywania i ilościowego oznaczania kwasu D-mlekowego. Niniejsza praca demonstruje opracowanie nowej i wysoce czułej metody analitycznej do jednoczesnego oznaczania i kwantyfikacji enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego. Metoda demonstruje zastosowanie chiralnej kolumny Astec CHIROBIOTIC® R firmy Supelco w LC-MS/MS do chiralnego rozdzielania enancjomerów kwasu L- i D-mlekowego. Ponadto liniowość i precyzja tej metody są dobre. Ta aplikacja jest szybka, prosta i powtarzalna do rutynowego klinicznego wykrywania enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego.
Izomery L- i D-kwasu mlekowego mogą przyczyniać się do kwasicy metabolicznej, ale ich względny wkład jest rozróżnialny ze względu na ich różne pochodzenie i szlaki metaboliczne. Dlatego ważne jest rozróżnienie izomerów kwasu mlekowego w osoczu, aby zrozumieć ich względny udział w kwasicy metabolicznej. Jednak ze względu na podobne właściwości fizyczne i chemiczne obu enancjomerów, trudno jest określić izomery kwasu mlekowego w próbkach biologicznych. Dlatego konieczne jest opracowanie czułej i niezawodnej metody oddzielania i ilościowego oznaczania enancjomerów kwasu mlekowego w próbkach moczu. Obecnie do pomiaru zawartości kwasu D-mlekowego w moczu stosuje się testy enzymatyczne z dehydrogenazą kwasu D-mlekowego. Jednak testy enzymatyczne nie są czułe i specyficzne w kontrolach moczu noworodków, ze względu na niskie poziomy kwasu D-mlekowego, które są poniżej poziomu kwantyfikacji metodą enzymatyczną.
Rysunek 1. Struktura L- i D-kwasu mlekowego
Obecne prace wykazały niezawodną i powtarzalną metodę analityczną do jednoczesnego oznaczania i ilościowego oznaczania enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego w moczu poprzez oczyszczanie i zatężanie kwasów organicznych, a następnie chromatografię chiralną sprzężoną z tandemowym MS. Metoda ta jest szybka, prosta i skuteczna w rutynowym klinicznym wykrywaniu enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego. W metodzie tej zastosowano kolumnę chiralną Astec CHIROBIOTIC R, która jest dostępna tutaj. Dzięki tej metodzie analitycznej, kwas L-mlekowy może być oznaczany ilościowo w zakresie 2-400 ìm/L, a kwas D-mlekowy może być oznaczany ilościowo w zakresie 0.5-100 µm/L, z dokładnością i wysoką precyzją (Rys. 2).
HPLC (izokratyczna w systemie HPLC MS-MS):
Kolumna: Astec CHIROBIOTIC R Chiral Column, 15 cm x 2,1 mm I.D., 5 µm (13019AST)
faza ruchoma:15% (v/v) 33.3 mM octan amonu w H2O i 85% (v/v) acetonitryl
prędkość przepływu: 0,7 mL/mi
temperatura kolumny.4 °C
detektor:MS, ESI(-), MRM, m/z 89.1/43.3, 90.1/44.3, 93.1/46.3
Rysunek 2.Chromatogram LC MS/MS pokazujący chiralne rozdzielenie kwasu L- i D-mlekowego w moczu przy użyciu kolumny Astec CHIROBIOTIC® R Chiral HPLC Column HPLC (izokratyczna w systemie HPLC MS-MS): kolumna: Astec CHIROBIOTIC® R Chiral Column, 15 cm x 2,1 mm I.D., 5 µm (Product No. 13019AST); faza ruchoma: 15% (v/v) 33,3 mM octan amonu w H2O i 85% (v/v) acetonitryl; szybkość przepływu: 0,7 mL/min; temp. kolumny: 4 °C; detektor: MS, ESI(-), MRM, m/z 89.1/43.3, 90.1/44.3, 93.1/46.3
Wnioski
Kolumna chiralna Astec CHIROBIOTIC® R jest najbardziej odpowiednia do enancjorozdzielania kwasów hydrofilowych, takich jak kwasy alfa-hydroksy/halogenowane i aminokwasy z blokadą N. Unikalny charakter jonowy tej fazy i zdolność wiązań H odgrywają ważną rolę w mechanizmie rozpoznawania chiralności. Oferujemy również szereg innych chiralnych faz stacjonarnych, które mogą być stosowane w powyższej wydajności do rozdzielania enancjomerów różnych cząsteczek.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.
