Multipleksowa analiza miokin: Jednoczesny pomiar wielu czynników wydzielanych przez mięśnie
- Czym są miokiny?
- Analiza multipleksowa miokin
- Methods
- Wyniki multipleksu
- Podsumowanie
- Powiązane produkty
- References
Zróżnicowane systemy miokin są zaangażowane w różne szlaki sygnalizacyjne. Multipleksowe testy immunologiczne miokin, takie jak MILLIPLEX® Human Myokine Panel, umożliwiają badaczom jednoczesny pomiar wielu czynników wydzielanych przez mięśnie, zapewniając lepszy wgląd w powiązane choroby.
Czym są miokiny?
Mięśnie szkieletowe są aktywnie zaangażowane w syntezę i wydzielanie wielu białek określanych wspólnym mianem "miokin". 1 Miokiny mogą działać autokrynnie i/lub parakrynnie, regulując metabolizm mięśni szkieletowych, proliferację mięśni i różnicowanie mięśni (wzrost mięśni), jak pokazano na rysunku 1.
.
Rysunek 1. Miokiny, wydzielane przez mięśnie szkieletowe, wysyłają sygnały do różnych narządów, w tym wątroby, trzustki, kości i układu krążenia. Dokładne mechanizmy, za pomocą których angiogeneza jest regulowana, są nadal badane. Na podstawie Pedersen BK, Febbraio MA. Mięśnie, ćwiczenia i otyłość: mięśnie szkieletowe jako narząd wydzielniczy. Nat Rev Endocrinol. 2012 Apr 3; 8(8): 457 - 65. 1
Miokiny mogą również działać jako hormony endokrynologiczne, zmieniając metabolizm komórek, funkcję śródbłonka i wzrost/opóźnienie guza. Miokiny te są również zaangażowane w reakcje zapalne w wielu różnych tkankach, w tym w sercu, tkance tłuszczowej, piersi, okrężnicy, wątrobie, jelitach, śródbłonku, kościach i mięśniach szkieletowych. Pojawiające się dowody potwierdzają fakt, że w przeciwzapalnych, zwalczających choroby efektach ćwiczeń mogą pośredniczyć te miokiny, a szlaki sygnałowe miokin przecinają się z wrodzoną odpornością, sygnalizacją neurologiczną i odpowiedzią na insulinę.2,3
Dodatkowo, postępująca utrata funkcji i masy mięśni szkieletowych, sarkopenia, jest poważną cechą starzenia się i kluczowym składnikiem zespołów geriatrycznych, które obejmują spadek funkcjonalny i majaczenie. Coraz więcej dowodów sugeruje, że pochodzące z mięśni czynniki wzrostu i cytokiny, zwane miokinami, modulują postęp chorób związanych z wiekiem i przyczyniają się do komunikacji między tkankami, która leży u podstaw ogólnoustrojowego starzenia się.
Myokine Multiplex Analysis
Rosnące zapotrzebowanie na ilościowe oznaczanie miokin w przedklinicznych i translacyjnych modelach badawczych stworzyło zapotrzebowanie na multipleksowe testy immunologiczne w tych badaniach. Analiza multipleksowa miokin pozwala badaczom na jednoczesny pomiar wielu miokin. Na przykład MILLIPLEX® Human Myokine Panel to 15-pleksowy zestaw przeznaczony do jednoczesnego oznaczania ilościowego dowolnych lub wszystkich poniższych analitów w próbkach surowicy lub osocza, które pełnią wskazane funkcje biologiczne opisane w Tabeli 1.
| Abbreviation | Analyte | Function |
|---|---|---|
| APLN | Apelina | Funkcja apeliny zależy od tkanki, w której ulega ekspresji. Apelina reguluje ciśnienie krwi w tkance naczyniowej, skurcze serca w tkance sercowej, przyjmowanie pokarmu i wody w mózgu oraz wychwyt glukozy i hamowanie insuliny w przewodzie pokarmowym. |
| BDNF | Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego | Wiązany z pamięcią długotrwałą, wydzielanie BDNF wzrasta w odpowiedzi na ćwiczenia. |
| EPO | Erytropoetyna | Ponieważ stymuluje produkcję czerwonych krwinek, może być podawana sportowcom w celu zwiększenia dopływu tlenu do organizmu, rzekomo poprawiając wydajność. |
| FABP3 | Białko wiążące kwasy tłuszczowe 3 | Miokina ta jest wytwarzana przez tkankę mięśnia sercowego i reguluje pobieranie przez serce długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Jest wiarygodnym i wczesnym biomarkerem zawału mięśnia sercowego i ostrych incydentów wieńcowych. |
| FGF-21 | FGF-21 jest aktywowany przez Akt i jest hormonem regulującym metabolizm i miokiną. | |
| N/A | Irisin | .Rozszczepiona i wydzielona część białka 5 zawierającego domenę fibronektyny typu III (FNDC5) - Niegdyś sporna funkcja iryzyny została teraz rozstrzygnięta w badaniu proteomicznym z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas.4 Poziom iryzyny wzrasta w odpowiedzi na ćwiczenia i może pośredniczyć w brązowieniu białej tkanki tłuszczowej. |
| FSTL1 | Białko związane z folistatyną 1 | .Regulowane przez sygnalizację tlenku azotu, FSTL1 indukuje wzrost nowych naczyń krwionośnych w mięśniach i chroni miocyty serca przed apoptozą wywołaną niedokrwieniem. |
| CX3CL | Fraktalkina | CX3CL1 jest białkiem chemokinowym ulegającym ekspresji na monocytach, komórkach naturalnych zabójców, limfocytach T i komórkach mięśni gładkich. Niedawno została powiązana z otyłością, insulinoopornością i cukrzycą typu 2. |
| IL-6 | Interleukina 6 | IL-6 jest w pewnym sensie "mistrzowską miokiną", ponieważ reguluje wiele różnych procesów w odpowiedzi na ćwiczenia, począwszy od produkcji glukozy, utleniania tłuszczu i lipolizy. IL-6 reguluje również odpowiedź immunologiczną na ćwiczenia i wyzwala sygnalizację przeciwzapalną. |
| IL-15 | Interleukina 15 | IL-15 reguluje aktywację i proliferację komórek T i NK. Jako miokina, znacząco redukuje trzewną tkankę tłuszczową. |
| LIF | Czynnik hamujący białaczkę | Białko to hamuje różnicowanie i może aktywować komórki macierzyste serca i mięśni w odpowiedzi na wysiłek fizyczny. |
| GDF8 | Czynnik różnicowania wzrostu 8 (miostatyna) | W pętli sprzężenia zwrotnego miostatyna hamuje wzrost komórek mięśniowych i blokuje różnicowanie komórek macierzystych w kierunku linii mięśniowych. |
| OSM | Okostatyna M | Okostatyna należy do rodziny cytokin IL-6 i prawdopodobnie współdzieli funkcje IL-6, szczególnie w regulacji stanu zapalnego. |
| OSTN | Osteokryna (musklina) | Główną rolą muskliny jest regulacja metabolizmu glukozy. |
| SPARC | Sekretowane białko kwaśne i bogate w cysteinę (osteonektyna) | SPARC jest miokiną, która blokuje progresję guza w okrężnicy poprzez indukowanie apoptozy w odpowiedzi na ćwiczenia. |
Tabela 1. Anality w panelu ludzkich miokin MILLIPLEX® i ich funkcje biologiczne.
Metody
Testy multipleksowe z wykorzystaniem standardów zawartych w zestawie testowym, a także próbek surowicy i osocza, przeprowadzono przy użyciu MILLIPLEX® Human Myokine Magnetic Bead Panel, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole. Kulki pokryte przeciwciałem wychwytującym inkubowano z próbkami w celu unieruchomienia analitu. Dodano biotynylowane przeciwciało wykrywające. To przeciwciało wykrywające wiąże się z analitem, tworząc kanapkę. Dodano barwnik streptawidyna-fykoerytryna (SA-PE), aby mógł wiązać się z kanapką i emitować światło fluorescencyjne.
Wyniki multipleksu
Używając wzorców dla każdego analitu seryjnie rozcieńczonego w matrycy surowicy, przygotowano krzywe standardowe w celu określenia odpowiedzi testu (mierzonej w średniej intensywności fluorescencji [MFI] w odniesieniu do stężenia analitu). Krzywe standardowe wykazały, że test wygenerował liniową odpowiedź MFI w zakresie od 3 do 5 rzędów wielkości dla wszystkich analitów (Rysunek 2).
Rysunek 2. Używając wzorców dla każdego analitu seryjnie rozcieńczonego w zwalidowanej matrycy surowicy, przygotowano krzywe standardowe w celu określenia odpowiedzi testu w odniesieniu do stężenia analitu. Krzywe standardowe ustaliły liniowość testu w zakresie od trzech do czterech rzędów wielkości dla wszystkich analitów. Stężenia analitu mierzono w MFI.
Reaktywność krzyżowa
Nie zaobserwowano znaczącej reaktywności krzyżowej w obrębie panelu. Większość przeciwciał w tym panelu ludzkich miokin może rozpoznawać próbki małp, z wyjątkiem fraktalkiny, LIF i IL-6. Stwierdzono następującą reaktywność krzyżową:
- Apelina reaguje krzyżowo z myszą, psem, królikiem i świnką miniaturową.
- BDNF reaguje krzyżowo z myszą i królikiem.
- EPO reaguje krzyżowo z psem i królikiem.
- IL-15 reaguje krzyżowo z koniem.
- Miostatyna reaguje krzyżowo z psem, świnką miniaturową i koniem.
- FABP3 reaguje krzyżowo ze szczurem, królikiem, świnką miniaturową i koniem.
- FSTL1 reaguje krzyżowo z myszą, królikiem, świnką miniaturową i koniem.
- OSM reaguje krzyżowo z psem i świnką miniaturową.
- FGF-21 reaguje krzyżowo z psem, świnką miniaturową i koniem.
Należy pamiętać, że w tym badaniu przetestowano tylko ograniczoną liczbę normalnych próbek i nie mogliśmy wykluczyć możliwej reaktywności krzyżowej w innych normalnych lub chorobowych próbkach.
Odzysk procentowy
Znane ilości każdego analitu (punkty 3, 4, 5 na krzywych wzorcowych) wprowadzono do normalnych próbek ludzkiej surowicy/osocza. Procent odzysku został obliczony przy użyciu następującego równania:
Obliczone stężenie analitu / oczekiwane stężenie *100
Odzysk wszystkich domieszkowanych próbek wynosił od 70% do 130%.
Spójność i dokładność z innymi panelami multipleksowymi
Aby sprawdzić spójność i dokładność między testami MILLIPLEX®, porównaliśmy kwantyfikację analitów występujących zarówno w tym panelu ludzkiej miokiny, jak i w innych panelach MILLIPLEX®. Wszystkie krzywe standardowe wykazywały nakładającą się odpowiedź, a stężenia analitów obliczone w próbkach biologicznych korelowały bardzo dobrze.
Na przykład wartości próbek FGF-21 i FABP3 mierzono zarówno przy użyciu panelu MILLIPLEX® Human Myokine, jak i paneli MILLIPLEX® Human Liver Protein i Human CVD1. Krzywe standardowe zostały utworzone przy użyciu standardów oczyszczonego FGF-21. FABP3 z dwóch paneli wykazał nakładającą się odpowiedź testu i zakres liniowy testów. Korelacja testu była doskonała, z nachyleniem i wartością R zbliżającą się do jedności (Rysunek 3).
Rysunek 3. Porównanie MILLIPLEX® Human Myokine Panel z MILLIPLEX® Liver Panel i MILLIPLEX®CVD Panel do pomiaru odpowiednio FGF-21 (góra) i FABP3 (dół).
Oprócz FGF-21 i FABP3, porównaliśmy te same anality w tym panelu ludzkich miokin z innymi panelami MILLIPLEX®. Wszystkie krzywe standardowe wykazały nakładające się odpowiedzi i stężenia analitów, które bardzo dobrze korelowały z próbkami biologicznymi (dane nie pokazane).
Próbki normalne vs. próbki z sepsą
Wreszcie, biologiczną kwalifikację panelu testowego przeprowadzono przy użyciu próbek surowicy/osocza od zdrowych osób i od osób z sepsą. Zgodnie z oczekiwaniami, w teście oznaczono ilościowo jednocześnie 15 nowych miokin. FABP3, Irisin, FSTL1, OSM, IL-6, FGF-21 i Musclin były znacząco podwyższone w próbkach sepsy (Tabela 2).
Podsumowanie danych próbki normalnej [pg/mL]
| Apelin | Fractalkine | BDNF | EPO | SPARC | LIF | IL-15 | Miostatyna | FABP3 | Irisin | FSTL1 | OSM | IL-6 | FGF-21 | Musclin | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| N | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 |
| Średnia | 228 | 101 | 9,548 | 1,239 | 425,343 | 10 | 3 | 8,625 | 1,943 | 495 | 6,491 | 13 | 3 | 134 | 150 |
| Min | 0 | 0 | 350 | 0 | 169,720 | 0 | 0 | 0 | 740 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Max | 420 | 260 | 20,480 | 3,460 | 739,890 | 30 | 20 | 40,110 | 3,110 | 2,370 | 17 170 | 37 | 9 | 570 | 790 |
| % Wykrywalny | 88 | 88 | 100 | 63 | 100 | 50 | 13 | 38 | 100< | 38 | 88 | 75 | 88 | 63 | 50 |
Podsumowanie danych próbki sepsy [pg/mL]
| Apelina | Fraktalkina | BDNF | EPO | SPARC | LIF | IL-15 | Miostatyna | FABP3 | Irisin | FSTL1 | OSM | IL-6 | FGF-21 | Musclin | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| N | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 |
| Średnia | 122 | 78 | 9,280 | 1,298 | 544,958 | 6 | 7 | 3,777 | 38,972 | 1,905 | 14,632 | 56 | 643 | 2,016 | 174 |
| Min | 0 | 0 | 110 | 0 | 204,800 | 0 | 0 | 0 | 240 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Max | 460 | 410 | 20,180 | 12 520 | 1 258 000 | 80 | 60 | 31 600 | 249 140 | 9 060 | 74,170 | 317 | 8,679 | 12,400 | 88...0* |
| % Wykrywalny | 69 | 69 | 100 | 41 | 100 | 19 | 25 | 28 | 100 | 60 | 84 | 97 | 81 | 75 | 59 |
Tabela 2. Porównanie biomarkerów wyrażonych w normalnych i septycznych próbkach surowicy/osocza. Wykazano, że FABP3, Irisin, FSTL1, OSM, IL-6, FGF-21 i Musclin były regulowane w górę w próbkach sepsy. *Nie badano.
Podsumowanie
Panel MILLIPLEX® Human Myokine Panel jest czuły, dokładny i powtarzalny. Wartości próbek wygenerowane za pomocą tego nowego panelu są zgodne z poprzednimi panelami, które zawierają niektóre z tych samych analitów. Panel ten zapewnia idealny test immunologiczny dla różnych obszarów badawczych, w tym chorób metabolicznych, nerwowo-mięśniowych i idiopatycznych miopatii.
Network error: Failed to fetch
Network error: Failed to fetch
Tylko do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.
