Testy multipleksowe cytokin nowej generacji

Rola cytokin, chemokin i czynników wzrostu

Cytokiny, chemokiny i czynniki wzrostu są kluczowymi mediatorami funkcji układu odpornościowego zdolnymi do sygnalizacji poprzez mechanizmy autokrynne, parakrynne i endokrynne. Ich plejotropowe właściwości immunomodulacyjne pozwalają tym biomolekułom reagować na różnorodne bodźce i regulować odpowiedź immunologiczną, promując lub hamując stan zapalny. Rosnące badania nadal podkreślają rolę układu odpornościowego w każdym aspekcie ludzkiego zdrowia i choroby. MILLIPLEX^® Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A i Panel B oferują unikalną kombinację 48 biomarkerów, które mogą być jednocześnie analizowane w małej objętości próbki.

Jakość wbudowana w zestawy MILLIPLEX^® Kits

.Rozwój i weryfikacja zestawów obejmuje testowanie selektywności i specyficzności w celu zapewnienia znikomej reaktywności krzyżowej w testowanych typach próbek, a także specyficzności testu w celu zapewnienia spójnej wydajności testu w formatach single-plex i multipleks. multiplex. Bufory i rozcieńczalniki są optymalizowane w celu zwiększenia swoistości przeciwciał, tak aby w próbkach wykrywane były tylko te anality, które są przedmiotem zainteresowania. Matryca surowicy jest również starannie dobrana i zoptymalizowana do użycia w krzywej wzorcowej podczas korzystania z próbek surowicy lub osocza, aby jak najdokładniej naśladować matrycę próbki, normalizując w ten sposób wydajność testu. Stężenie streptawidyny-fykoerytryny (SAPE) jest miareczkowane we własnym zakresie w celu uzyskania optymalnego sygnału i jest dostarczane jako gotowe do użycia bez konieczności rozcieńczania. Ponadto wszystkie nasze zestawy są rygorystycznie testowane pod kątem stabilności wysyłki, a próbki są również testowane pod kątem tolerancji na temperaturę i zamrażanie/rozmrażanie.

Rozcieńczenie próbki jest zoptymalizowane dla każdego analitu w zestawie, zapewniając, że istotne biologicznie wartości próbki są wykrywalne i mieszczą się w zakresie dynamicznym krzywych standardowych. Próbki testowane dla tego zestawu obejmują normalne i chore próbki surowicy i osocza, a także supernatanty komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC, niestymulowane i stymulowane różnymi czynnikami). Kontrole jakości (QC), które są niskimi i wysokimi rozcieńczeniami rekombinowanych białek dla każdego analitu, są wytwarzane w taki sposób, że dwie QC (wysoka i niska) mają optymalne położenie na każdej krzywej standardowej. Arkusze zakresów QC są dostarczane z każdym zestawem. Ponadto zawsze zalecamy użytkownikom dołączenie próbek specyficznych dla eksperymentu do wykorzystania jako kontrole w każdym teście.

Dowiedz się więcej w naszym artykule na temat jakości zestawów MILLIPLEX^®.

Ulepszenia przepływu pracy

Analizy zawierające 48 indywidualnych biomarkerów w jednym panelu stanowią potężne narzędzie do badań. Możliwość wyboru wszystkich analitów i zawężenia ich do podzbioru analitów w miarę kontynuowania projektu pozwala badaczom na elastyczność potrzebną do wydajnej pracy. Wykrywanie cytokin na poziomie pg/mL z zakresami krzywych standardowych, które nie zmieniają się z partii na partię, sprawia, że test jest bardzo przyjazny dla użytkownika. Spójne krzywe standardowe z partii na partię zapewniają spójne wyniki próbek w całym projekcie (rysunek 1).

Panele MILLIPLEX^® Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A i Human Cytokine Panel B mają prosty protokół ze znanym przepływem pracy, w którym każdy krok jest opisany w celu zapewnienia łatwości użytkowania.

Kolejnym ulepszeniem testu w stosunku do MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel A jest to, że PDGF-AA i PDGF-AB/BB można teraz badać za pomocą czystych próbek surowicy i osocza, więc nie ma potrzeby rozcieńczania próbek, jak ma to miejsce w przypadku poprzednich zestawów MILLIPLEX^®.sup>® lub innych zestawów opartych na technologii Luminex^® dostępnych na rynku. RANTES, będąc wysoce wyrażonym w próbkach surowicy i osocza, nadal wymaga oddzielnego rozcieńczenia próbki w surowicy i osoczu w stosunku 1:100.

Proste ulepszenie testu polegające na logicznym uporządkowaniu regionów kulek i nazw analitów w kolejności numeryczno-alfabetycznej, pozwala badaczom szybko zlokalizować określone anality w plikach wyjściowych wyników znacznie łatwiej niż w przypadku poprzednich testów.

Wykrywalność próbek

Panel ludzkich cytokin A

Oprócz ulepszeń w krzywych standardowych w stosunku do porównawczych testów analitów dla MILLIPLEX^® Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A, istnieje również poprawa wydajności analitu pod względem wykrywania próbki. Jednym z celów przy opracowywaniu tego panelu było ścisłe dopasowanie wartości próbek do porównawczych zestawów MILLIPLEX^® (nr kat. HCYTOMAG-60). Nr kat. HCYTOMAG-60K, HCYP3MAG-63K, lub HTH17MAG-14K). Warto zauważyć, że trzy testy analitów zostały dostosowane, aby lepiej odpowiadały wartościom akceptowanym w literaturze: GROα^1,2, IL-4¹ i IL-22^3,4,5. Rysunki 2 i 3 pokazują, w jaki sposób panel ten został wykorzystany odpowiednio do analizy próbek chorobowych i stymulowanych PBMC.

Więcej szczegółów można znaleźć w naszym MILLIPLEX^® Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A application note.

Panel ludzkich cytokin B

Zestaw 48-pleksowy MILLIPLEX^® Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel B został przetestowany w porównaniu z innymi zestawami marki Luminex^®.sup>® Brand, w tym Brand 1, który oferuje test odkrywczy i test wydajnościowy, który podobno obejmuje wyższy poziom weryfikacji testu.

W tym porównaniu testy odkrywcze Brand 1 są określane jako Brand 1D, a testy wydajnościowe są określane jako Brand 1P. MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B został również porównany z innymi zestawami partnerskimi Luminex^®, tutaj określanymi jako Brand 2 i Brand 3.

Granzym B w MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B wykazał 100% wykrywalność próbki zarówno w zdrowej, jak i chorej surowicy i osoczu (rysunek 4A). I odwrotnie, marka 1P miała tylko 2 wykrywalne próbki chorobowe i żadna ze zdrowych próbek nie została odczytana powyżej tła. Test odkrywczy tej samej marki wykazał lepszą wykrywalność próbek, która była porównywalna pod względem zakresu próbek dla zdrowych i chorych próbek do MILLIPLEX^® Human Panel B. Zgodnie z wyszukiwaną literaturą, typowe poziomy Granzymu B powinny mieścić się w przedziale 2-50 pg/ml,^6,7 przy średniej próbce zdrowej surowicy i osocza panelu MILLIPLEX^® na poziomie 8.

W przypadku ligandu indukującego apoptozę związanego z TNF (TRAIL), wszystkie zdrowe i chore próbki były wykrywalne przy użyciu MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B. Marka 1P miała 9/16 (56%) wykrywalnych próbek choroby. Jako regulator odpowiedzi immunologicznej w sepsie, obniżone poziomy TRAIL w sepsie były związane ze złymi wynikami.⁸ MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B podążał za tym trendem obniżonego stężenia TRAIL w próbkach stanu chorobowego, w tym w sepsie, co zostało również wykazane w mniejszym stopniu w innych panelach multipleksowych marki (rysunek 4B). Wykazano, że zdrowy poziom TRAIL wynosi średnio około 50-100 pg/ml, co jest zgodne z wynikami MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B.

MIP-3β był wykrywalny w 100% zdrowych próbek surowicy i osocza przy użyciu zestawu MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B. W porównaniu z innymi zestawami marki, średnie wyniki były zgodne z zestawami marki 2 i marki 3 i były zgodne z zakresami literaturowymi.⁹ Zestawy marki 1D i 1P wykazały fałszywie dodatnie wyniki w dwóch próbkach, odczytując prawie 3-krotnie wyższe niż inne zdrowe próbki w 5 zestawach multipleksowych (rysunek 4C). Zestawy marek 2 i 3 miały wykrywalne poziomy MIP-3β w 89% próbek surowicy i osocza, w tym w próbkach w stanie chorobowym (dane nie pokazane).

CXCL6/GCP-2 wykazał 100% wykrywalność próbki przy użyciu zestawu MILLIPLEX^® Human Cytokine Panel B ze średnimi wartościami zgodnymi z zestawami marek 2 i 3. MILLIPLEX^® Panel B był również zgodny z zakresami literaturowymi 40-350 pg/mL.¹⁰ Podobnie jak w przypadku innych analitów, zestaw marki 1D ponownie wykazał fałszywie dodatnie wyniki przy średnim stężeniu zdrowej próbki prawie czterokrotnie wyższym niż w przypadku innych testów (rysunek 4D). Tylko 55% zdrowych próbek było wykrywalnych przy użyciu testu multipleksowego marki 2, który miał ogólny wskaźnik wykrywalności próbek na poziomie 58%, biorąc pod uwagę również próbki w stanie chorobowym (dane nie pokazane).

W niektórych przypadkach stężenia próbek w MILLIPLEX^® Human Panel B mogą nie odpowiadać poprzednim zestawom, ale są teraz bardziej zgodne z zakresami literaturowymi. Obejmuje to anality takie jak BAFF,¹¹ HMGB1,¹² SCF,¹³ IL-28A,¹⁴ i IL-23.¹⁵

Więcej szczegółów można znaleźć w naszym Nota aplikacyjna MILLIPLEX^® Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel B.

Tylko do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Ostatnie publikacje wykorzystujące panele ludzkich cytokin MILLIPLEX^®

• Cytokiny i fenotyp komórek odpornościowych w ostrym uszkodzeniu nerek związanym z inhibitorami immunologicznego punktu kontrolnego. Farooqui N, Zaidi M, Vaughan L, McKee TD, Ahsam E, Pavelko KD, Villasboas JC, Markovic S, Taner T, Leung N, et al. 2022. 8(3):628-641. doi:https://doi.org/10.1016/j.ekir.2022.11.020.
• Kliniczne i biochemiczne krótkoterminowe skutki hiperbarycznej terapii tlenowej u hospitalizowanych pacjentów SARS-Cov-2+ z hipoksemiczną niewydolnością oddechową. Keller GA, Colaianni I, Coria J, Di Girolamo G, Miranda S. 2023. Medycyna oddechowa. 209:107155. Doi:https://doi.org/10.1016/j.rmed.2023.107155.
• Plasma Cytokines/Chemokines as Predictive Biomarkers for Lymphedema in Breast Cancer Patients. Vang AR, Shaitelman SF, Rasmussen JC, Chan W, Sevick-Muraca EM, Aldrich MB. 2023. Cancers. 15(3):676. doi:https://doi.org/10.3390/cancers15030676.
• Sieci proteomiczne surowicy wiążą się z przedklinicznymi autoprzeciwciałami reumatoidalnego zapalenia stawów i wynikami podłużnymi. O'Neil LJ, Meng X, Mcfadyen C, Fritzler MJ, El-Gabalawy HS. 2022. Frontiers in Immunology. 13:958145. doi:https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.958145.
• Wpływ poziomu IL-2 w surowicy na rokowanie pierwotnej niewydolności wątroby związanej z zapaleniem dróg żółciowych i wstępne badanie jej mechanizmu. Wang Q, Wang Y, Qiao W, Xu B, Liu Y, Zhang X, Li W, Zhao J, Liu M, Zhang Y, et al. 2022. Frontiers in Immunology. 13:995223. doi:https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.995223.
• Transcriptomic Profiling Reveals a Role for TREM-1 Activation in Enterovirus D68 Infection-Induced Proinflammatory Responses. Li J, Yang S, Liu S, Chen Y, Liu H, Su Y, Liu R, Cui Y, Song Y, Teng Y, et al. 2021. Frontiers in Immunology. 12. doi:https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.749618.
• Integracyjna immunologiczna klasyfikacja transkryptomiczna poprawia selekcję pacjentów do precyzyjnej immunoterapii w zaawansowanym gruczolakoraku żołądka i przełyku. Cabeza-Segura M, Gambardella V, Gimeno-Valiente F, Carbonell-Asins JA, Alarcón-Molero L, González-Vilanova A, Zuñiga-Trejos S, Rentero-Garrido P, Villagrasa R, Gil M, et al. 2022. British Journal of Cancer. 127(12):2198–2206. doi:https://doi.org/10.1038/s41416-022-02005-z.
• Stan epigenetyczny determinuje wyczuwanie stanu zapalnego w neuroblastoma.
  Wolpaw AJ, Grossmann LD, Dessau JL, Dong MM, Aaron BJ, Brafford PA, Volgina D, Pascual-Pasto G, Rodriguez-Garcia A, Uzun Y, et al. 2022. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 119(6): https://doi.org/10.1073/pnas.2102358119.
• Regulatory T Cells Control Effector T Cell Inflammation in Human Prediabetes. Liu R, Pugh GH, Tevonian E, Thompson K, Lauffenburger DA, Kern PA, Nikolajczyk BS. 2022. 71(2):264-274. https://doi.org/10.2337/db21-0659.
• Inhibicja czynnika martwicy nowotworów poprawia konwencjonalną steroidoterapię zespołu Stevensa-Johnsona/toksycznej nekrolizy naskórka w kohorcie pacjentów. Ao S, Gao X, Zhan J, Ai L, Li M, Su H, Tang X, Chu C, Han J, Wang F. 2022. Journal of the American Academy of Dermatology. https://doi.org/10.1016/j.jaad.2022.01.039.