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Hexanukleotid-Gemisch

solution, pkg of 100 μL, sufficient for 50 labeling reactions

• Synonym(e): Nukleotidmischung
• UNSPSC-Code: 41106300

Eigenschaften

• Form: solution
• Qualitätsniveau: 100
• Verwendung: sufficient for 50 labeling reactions
• Verpackung: pkg of 100 μL
• Hersteller/Markenname: Roche
• Methode(n): Northern blotting: suitable; Southern blotting: suitable; cDNA synthesis: suitable (first strand); hybridization: suitable
• Farbe: colorless
• Löslichkeit: water: miscible
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Praktische Oligonukleotidmischung für die schnelle Random-Priming-Markierung von DNA mit radioaktiven, digoxigenin- oder biotinmarkierten Nukleotiden. Bei dieser Methode wird der komplementäre DNA-Strang mittels der Klenow-Polymerase unter Verwendung der 3′-OH-Termini der zufälligen Oligonukleotide als Primer synthetisiert.

Spezifität

Hitzeinaktivierung: Zum Abbrechen der Reaktion 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8,0) zugeben bzw. 10 Minuten lang auf 65 °C erhitzen.

Anwendung

Die Hexanukleotid-Mischung ist eine Mischung von Hexanukleotiden aller möglichen Sequenzen zur Markierung von DNA mittels Random Priming.
Markierte DNA-Sonden mit hoher spezifischer Aktivität werden bei vielen verschiedenen Hybridisierungsmethoden eingesetzt:

• Screening von Genbibliotheken
• Southern Blot und Northern Blot
• In-situ-Hybridisierungen
• RT-PCR
• Generierung von cDNA-Bibliotheken
• Synthese von Erststrang-cDNA
• Bestimmung des Vektortiters
• Zweitstrangsynthese

Leistungsmerkmale und Vorteile

Das Produkt ist eine 10-fach konzentrierte Mischung aus zufälligen Hexanukleotiden. Statistisch gesehen kann die Mischung bis zu 4.096 verschiedene Hexanukleotide enthalten, die wahrscheinlich jedoch in unterschiedlichen Mengen vorhanden sind.

Inhalt
10-fach konzentrierte Mischung aus Hexanukleotiden (62,5 A₂₆₀ Einheiten/mL) im Reaktionspuffer [0,5 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl₂, 1 mM Dithioerythritol (DTE), 2 mg/mL BSA, pH 7,2 (+20 °C)]
Hinweis: Die Mischung ist identisch mit der in Fläschchen 5 des DIG-DNA-Markierungs- und Detektionskits und des DIG-DNA-Markierungskits sowie in Fläschchen 6 des Random-Priming-DNA-Markierungskits gelieferten Mischung.

Qualität

Funktionsgetestet im Random-Priming-DNA-Markierungskit.

Prinzip

Die von Feinberg und Vogelstein entwickelte DNA-Markierungsmethode „Random Priming“ basiert auf der Hybridisierung einer Mischung aller möglichen Hexanukleotide an die zu markierende DNA. Alle Sequenzkombinationen sind in der Hexanukleotid-Primermischung vertreten, was zu einer statistischen Bindung des Primers an die Template-DNA führt. Dadurch wird eine gleichmäßige Markierung über die gesamte Länge der Template-DNA gewährleistet. Der komplementäre Strang wird aus den 3′-OH-Termini des Random-Hexanukleotid-Primers unter Verwendung des Klenow-Enzyms, Markierungsgrad, synthetisiert. Die in der Reaktion vorhandenen modifizierten Desoxyribonukleosidtriphosphate ([³²P], [³⁵S],[³H] oder [¹²⁵I] digoxigenin- oder biotinmarkiert) werden in den neu synthetisierten komplementären DNA-Strang eingebaut.

Angaben zur Herstellung

Testzeit
Standardmarkierung (radioaktiv): 50 Minuten
Markierungs-Assay mit Digoxigenin-11-dUTP: 80 Minuten

Probenmaterialien

• DNA-Fragmente
• Linearisierte Plasmid-DNA
• λDNA

Hinweis: Die Länge der zu markierenden DNA-Fragmente hat keinen Einfluss auf die Reaktion. DNA-Fragmente mit einer Länge von 100 bp werden genauso gut markiert wie linearisierte Plasmid- oder λ-DNA. Die eingesetzte DNA dient lediglich als Template für die Synthese von markierter DNA und wird während der Reaktion nicht abgebaut, sodass mit dieser Methode minimale Mengen der DNA (10 ng) markiert werden können.

Synthese: Zur Synthese dieser zufälligen Hexanukleotidmischung werden alle 4 Basen verwendet. In der Anfangsreaktion werden die Starter-Nukleotide an einen Festphasenträger gebunden. In den nachfolgenden Kopplungsreaktionen werden äquimolare Mengen der 4 dNTPs an die Starter-Nukleotide gebunden, bis Hexamere entstehen. Diese Hexamere werden anschließend aus dem Festphasenträger gelöst.
Nach der Synthese: Die Oligonukleotide werden durch HPLC aufgereinigt, entsalzt und 5′-phosphoryliert.

Hinweis zur Analyse

Absorption: 62,5 A₂₆₀ Einheiten entsprechen 2,5 mg/mL an Hexanukleotiden.

Sonstige Hinweise

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren geeignet.

Sicherheitshinweise

• Lagerklassenschlüssel: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): No data available
• Flammpunkt (°C): No data available