S7150
OxyBlot Proteinoxidations-Nachweiskit
The OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit provides the reagents to perform the immunoblot detection of carbonyl groups introduced into proteins by oxidative reactions with ozone or oxides of nitrogen or by metal catalyzed oxidation.
Synonym(e):
OxyBlot assay, Protein oxidation kit
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About This Item
UNSPSC-Code:
12161503
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.84
Empfohlene Produkte
Qualitätsniveau
Hersteller/Markenname
Chemicon®
OxyBlot
Methode(n)
western blot: suitable
Nachweisverfahren
chemiluminescent
Versandbedingung
wet ice
Allgemeine Beschreibung
Die oxidative Modifikation von Proteinen durch freie Sauerstoffradikale und andere reaktive Spezies tritt in physiologischen und pathologischen Vorgängen auf. Als Folge der Modifikation werden Carbonylgruppen durch einen stellenspezifischen Mechanismus in Proteinseitenketten eingebracht. Das OxyBlot-Kit stellt Reagenzien für eine einfache und empfindliche Immundetektion dieser Carbonylgruppen bereit, was ein Merkmal des Oxidationszustands von Proteinen ist.
Anwendung
Aufbereitung von Zelllysat
1. Waschen Sie anhaftende Zellen zweimal in der Schale oder dem Kolben mit eiskaltem PBS und lassen Sie das PBS abfließen. Waschen Sie nicht anhaftende Zellen in PBS und zentrifugieren Sie bei 800 bis 1.000 U/min in einer Tischzentrifuge 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.
2. Geben Sie eiskalten RIPA-Puffer zu den Zellen (1 ml je 107 Zellen/100-mm-Schale/150-cm²-Kolben; 0,5 ml je 5 x 106 Zellen/60-mm-Schale/75-cm²-Kolben).
3. Schaben Sie anhaftende Zellen entweder mit einem Gummiwischer oder Kunststoff-Zellschaber, der in eiskaltem destillierten Wasser gekühlt wurde, von der Schale oder dem Kolben ab. Geben Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Schütteln Sie die Suspension vorsichtig entweder auf einem Wippschüttler oder Kreisschüttler 15 Minuten lang in einem kalten Raum, um Zellen zu lysieren.
4. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge 15 Minuten lang. Geben Sie den Überstand sofort in ein frisches Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie den Rückstand.
5. Verdünnen Sie das Zelllysat mindestens 1:10, bevor Sie die Proteinkonzentration bestimmen, aufgrund der Überlagerung des Detergens im Lysepuffer mit dem Reagens auf Coomassie-Basis. In diesem Schritt kann die Probe in Aliquote unterteilt und bei -20 ¡C bis zu einen Monat aufbewahrt werden.
HINWEIS: Wenn Sie mit großen Volumina von nicht anhaftenden Zellen arbeiten, könnten die Zellen nicht schnell genug gekühlt werden, um die Aktivität des zu untersuchenden Proteins zu erhalten. Schütten Sie die Zellsuspension in diesem Fall in eine Mischung einer gleichen Masse aus 2 x PBS und Eis. Sammeln Sie die Zellen anschließend mittels Zentrifugieren und führen Sie die Lyse wie vorstehend beschrieben durch.
RIPA-Lysepuffer:
Katalognummer 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
Reduktionsmittel ist sehr wichtig, um eine Oxidation zu verhindern:
Das Proteinlysat kann durch eine Reihe an Protokollen hergestellt werden. Die meisten Standardpuffer wie RIPA und Triton eignen sich auch. Es empfiehlt sich, ein Reduktionsmittel zum Lysepuffer zu geben, um die Oxidation von Proteinen, die nach der Zelllyse auftreten kann, zu verhindern. Lysepuffer, der entweder 1 bis 2 % 2-Mercaptoethanol oder 50 mM DTT enthält, hemmt diese Oxidation ausreichend, weist aber keine nachteilige Wirkung auf die Derivatisierungsreaktion im OxyBlot Protokoll auf. Aufgereinigte Proteinproben eignen sich auch für die Analyse mit dem OxyBlot Kit.
Für allgemeine Informationen zur Proteinextraktion sehen Sie sich bitte folgenden Link an:
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
1. Waschen Sie anhaftende Zellen zweimal in der Schale oder dem Kolben mit eiskaltem PBS und lassen Sie das PBS abfließen. Waschen Sie nicht anhaftende Zellen in PBS und zentrifugieren Sie bei 800 bis 1.000 U/min in einer Tischzentrifuge 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.
2. Geben Sie eiskalten RIPA-Puffer zu den Zellen (1 ml je 107 Zellen/100-mm-Schale/150-cm²-Kolben; 0,5 ml je 5 x 106 Zellen/60-mm-Schale/75-cm²-Kolben).
3. Schaben Sie anhaftende Zellen entweder mit einem Gummiwischer oder Kunststoff-Zellschaber, der in eiskaltem destillierten Wasser gekühlt wurde, von der Schale oder dem Kolben ab. Geben Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Schütteln Sie die Suspension vorsichtig entweder auf einem Wippschüttler oder Kreisschüttler 15 Minuten lang in einem kalten Raum, um Zellen zu lysieren.
4. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge 15 Minuten lang. Geben Sie den Überstand sofort in ein frisches Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie den Rückstand.
5. Verdünnen Sie das Zelllysat mindestens 1:10, bevor Sie die Proteinkonzentration bestimmen, aufgrund der Überlagerung des Detergens im Lysepuffer mit dem Reagens auf Coomassie-Basis. In diesem Schritt kann die Probe in Aliquote unterteilt und bei -20 ¡C bis zu einen Monat aufbewahrt werden.
HINWEIS: Wenn Sie mit großen Volumina von nicht anhaftenden Zellen arbeiten, könnten die Zellen nicht schnell genug gekühlt werden, um die Aktivität des zu untersuchenden Proteins zu erhalten. Schütten Sie die Zellsuspension in diesem Fall in eine Mischung einer gleichen Masse aus 2 x PBS und Eis. Sammeln Sie die Zellen anschließend mittels Zentrifugieren und führen Sie die Lyse wie vorstehend beschrieben durch.
RIPA-Lysepuffer:
Katalognummer 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
Reduktionsmittel ist sehr wichtig, um eine Oxidation zu verhindern:
Das Proteinlysat kann durch eine Reihe an Protokollen hergestellt werden. Die meisten Standardpuffer wie RIPA und Triton eignen sich auch. Es empfiehlt sich, ein Reduktionsmittel zum Lysepuffer zu geben, um die Oxidation von Proteinen, die nach der Zelllyse auftreten kann, zu verhindern. Lysepuffer, der entweder 1 bis 2 % 2-Mercaptoethanol oder 50 mM DTT enthält, hemmt diese Oxidation ausreichend, weist aber keine nachteilige Wirkung auf die Derivatisierungsreaktion im OxyBlot Protokoll auf. Aufgereinigte Proteinproben eignen sich auch für die Analyse mit dem OxyBlot Kit.
Für allgemeine Informationen zur Proteinextraktion sehen Sie sich bitte folgenden Link an:
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
Lagerung und Haltbarkeit
Lagern Sie den Proteinstandard (Komponente 90450) nach Erhalt bei -25 °C bis -15 °C. Lagern Sie alle anderen Komponenten bei 2 °C bis 8 °C.
Rechtliche Hinweise
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Haftungsausschluss
Sofern in unserem Katalog oder anderen Begleitdokumenten unserer Produkte nicht anders angegeben, sind unsere Produkte nur für Forschungszwecke vorgesehen und nicht für andere Zwecke zu verwenden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf unautorisierte kommerzielle Verwendung, zur In-vitro-Diagnostik, für Ex-vivo- oder In-vivo-Therapiezwecke oder jegliche Art der Einnahme oder Anwendung bei Menschen oder Tieren.
Signalwort
Warning
H-Sätze
Gefahreneinstufungen
Met. Corr. 1 - Skin Sens. 1
Lagerklassenschlüssel
8A - Combustible corrosive hazardous materials
Analysenzertifikate (COA)
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