最適なカスタムqPCRプローブの選択
qPCRに使えるカスタムプローブには幅広い選択肢があり、それぞれアプリケーションごとに異なる利点があります。一般的に用いられるカスタムqPCRプローブのアプリケーションを以下にまとめました。
アプリケーションレファレンスガイド
| SYBR® Green I* | 両末端標識プローブ | 両末端標識 Locked Nucleic Acid™ プローブ | Molecularビーコン* | LightCycler®プローブ*（日本国内取扱いなし） | Scorpions®プローブ* | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| アプリケーション | ||||||
| 質量スクリーニング | • • | |||||
| マイクロアレイバリデーション | • • | • | ||||
| 複数標的遺伝子／少量のサンプル | • | • | ||||
| SNP検出 | • • | • | • | • • | ||
| 対立遺伝子の識別 | • • | • | • | • • | ||
| 病原体検出 | • | • | • • | • | • | • • |
| マルチプレックス | • • | • • | • • | • | • • | |
| ウイルス量の定量化 | • | • • | • | • | • • | |
| 遺伝子発現解析 | • | • • | • • | • • | • • | • • |
| 遺伝子コピー数の決定 | • | • • | • | • | • • | |
| エンドポイントジェノタイピング | • • | • • | ||||
| in vitro定量または検出 | • | • • | ||||
レポーター、クエンチャー、装置との適合性
近年のqPCRプラットフォームには通常複数の検出チャネルがあり、プローブ標識選択に柔軟性があります。qPCR機器の検出チャネルと互換性のある蛍光ラベルを選択し、機器の正しいフィルター設定または検出キャリブレーションを確保することが重要です。レポーターと装置の対応表には最も広く用いられるqPCRプラットフォームと、どの蛍光標識が使用できるかを示します。この表はあらゆる標識を網羅したものではなく、別のレポーターもお届けできます。これらのプラットフォームでの標準以外の標識の使用については、テクニカルサービスまでお問い合わせください。
色素代替品
qPCR装置によっては、通常市販されていない独自の色素（VIC™やNED™色素など）を用います。色素の代替品をお探しの場合、次の条件にご注意ください。
- 励起波長と検出波長が装置の光源と検出システムに対応していること
- プローブに関しては、クエンチャーが効果的にレポーターの発光波長で吸光すること
- 消光係数が高いほど色素は明るくなり、これが高感度の検出に結びつくこと
- 複数の色素を使う（マルチプレックス）場合、各色素の励起波長と発光波長は独立させ、クロストークを避けること
クエンチャー
クエンチング分子は、通常デュアルラベルプローブ、モレキュラービーコン、Scorpions®プローブなど、単分子プローブの3'末端に配置されます。クエンチャーには蛍光（TAMRA™）または非蛍光（DABCYL、Black Hole Quencher® [BHQ®]）の分子があります。最適なパフォーマンスを得るには、クエンチャーの吸収スペクトルは、レポーターの発光スペクトルとできるだけマッチするようにしてください。スペクトル特性表には、レポーターとクエンチャーの推奨する組み合わせを示します。
| 色素 | 最大 励起（nm） | 最大 発光（nm） | 対応 クエンチャー |
|---|---|---|---|
| 6-FAM™ | 495 | 520 | BHQ®-1、TAMRA™ |
| JOE™ | 529 | 555 | BHQ®-1、TAMRA™ |
| TET™ | 521 | 536 | BHQ®-1、TAMRA™ |
| Cal Fluor® Gold 5401 | 522 | 544 | BHQ®-1 |
| HEX™2 | 535 | 556 | BHQ®-1、TAMRA™ |
| Cal Fluor® Orange 5602 | 538 | 559 | BHQ®-1 |
| TAMRA™ | 557 | 583 | BHQ®-2 |
| Cyanine 3 | 549 | 566 | BHQ®-2 |
| Quasar® 5703 | 548 | 566 | BHQ®-2 |
| Cal Fluor® Red 5904 | 569 | 591 | BHQ®-2 |
| ROX™ | 586 | 610 | BHQ®-2 |
| TxRd (Sulforhodamine 101-X) | 597 | 616 | BHQ®-2 |
| Cyanine 5 | 646 | 669 | BHQ®-3 |
| Quasar® 6705 | 647 | 670 | BHQ®-3 |
| Cyanine 5.5 | 675 | 694 | BHQ®-3 |
| 1JOE™/TET™に代替可能 2VIC™に代替可能 3Cyanine 3に代替可能 4TAMRA™に代替可能 5Cyanine 5に代替可能 | |||
| プラットフォーム | SYBR Green I | FAM™ | HEX™ | JOE™ | ROX™ | TET™ | Cya- nine 3 | Cya- nine 5 | TAMRA™ | TxRd | LC Red 640 | LC Red 705 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ABI 7900HT | • | • | • | • | • | • | • | |||||
| ABI 7300 | • | • | • | • | • | • | ||||||
| ABI 7500 | • | • | • | • | • | • | • | • | • | |||
| ABI 7700 | • | • | • | • | • | • | ||||||
| ABI 7000 | • | • | • | • | • | |||||||
| ABI StepOne™ | • | • | • | • | • | • | • | |||||
| ABI StepOnePlus™ | • | • | • | • | • | • | • | |||||
| Bio-Rad® iQ™ 5 | • | • | • | • | • | • | • | • | • | |||
| Bio-Rad® Opticon™ 2 | • | • | • | • | • | |||||||
| Bio-Rad® Chromo4™ | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | ||
| Bio-Rad® MyiQ™ | • | • | ||||||||||
| Bio-Rad® MiniOpticon™ | • | • | ||||||||||
| Bio-Rad® CFX96™ | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • |
| Bio-Rad® SFX384™ | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • |
| Agilent® Mx4000™ | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | ||
| Agilent® Mx3000P™ | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | ||
| Agilent® Mx3005P™ | • | • | • | • | • | • | • | • | • | • | ||
| Roche® LightCycler® | • | • | • | • | ||||||||
| Roche® LightCycler® 2（日本国内取扱いなし） | • | • | • | • | • | |||||||
| Roche® LightCycler® 480（日本国内取扱いなし） | • | • | • | • | • | • | ||||||
| Cepheid® SmartCycler® | • | • | • | • | • | |||||||
| Cepheid® SmartCycler® II | • | • | • | • | • | • | ||||||
| Qiagen® Rotor-Gene® 6000 | • | • | • | • | • | • | • | • | • | |||
| Eppendorf® Mastercycler® realplex（日本国内取扱いなし） | • | • | • | • | • | • | • | |||||
| 注記：あらゆるqPCR装置や蛍光色素分子を網羅したものではありません。対応蛍光色素分子については装置メーカーにお問い合わせください。 | ||||||||||||
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