Kapa Biosystems社のTaq DNAポリメラーゼ・PCRキット

DNA抽出・増幅用のTaq DNAポリメラーゼPCR試薬およびキット

DNAの抽出と増幅は分子生物学研究のワークフローにおける重要なステップであり、多くの場合、精製された高品質のDNAが必要となります。Kapa Biosystems社は、さまざまな哺乳類や植物由来の遺伝物質を抽出および増幅するためのDNAポリメラーゼ試薬とPCRキットのロバストなポートフォリオを提供しています。革新的な熱安定性ポリメラーゼを組み込んだ、私たちのKapa Biosystems社製試薬およびキットは、さまざまなアプリケーションに対する感度と特異性を向上させることにより、お客様の次の発見を実現できるように設計されています。

• KAPA Taq DNAポリメラーゼ
• KAPA2G Fast Multiplex
• KAPA2G Robust DNAポリメラーゼ
• KAPA Long Range PCR System
• KAPA Mouse Genotyping
• KAPA Express Extract
• KAPA3G Plant PCRキット

KAPA Taq DNAポリメラーゼ

ルーチンPCRに必要な高い品質と性能

KAPA Taq DNAポリメラーゼは、好熱菌Thermus aquaticusの単一サブユニットの野生型Taq DNAポリメラーゼを基にしています。KAPA TaqおよびKAPA Taq HotStart DNAポリメラーゼには、5'-3'ポリメラーゼと5'-3'エキソヌクレアーゼ活性はありますが、3'-5'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性はありません。この酵素のエラー率は、取り込まれる2.2×10⁵ヌクレオチドあたり約1エラーです。

KAPA Taq DNAポリメラーゼキットは以下の目的に理想的です：

• Standard PCR
• DNAラベリング
• DNAシーケンシング
• 高品質の熱安定性DNAポリメラーゼが必要とされる多くのアプリケーション

利点：

• 感度、特異性、収率の向上
• 新規の緩衝液処方により特異的プライマーアニーリングが促進され、特異的産物の収率が高くなっています

図1. CCR5遺伝子の500 bpフラグメントを、100 ng、10 ng、1 ngまたは100 pgのヒトゲノムDNAをテンプレートとして増幅。KAPA Taq HotStartは、競合するHotStart製品と比較して、感度、特異性、収率が改善されている。すべての反応は、メーカー推奨のプロトコルを用いて実施した。

図2. マイコプラズマDNAからKAPA TaqまたはKAPA Taq HotStartを用いて270 bpのアンプリコンを増幅。1 ngのDNAから開始したテンプレートの10倍希釈系列を用いて感度を試験した。

KAPA2G FAST MULTIPLEX

高速・高性能マルチプレックスPCR

KAPA2G Fast Multiplex PCRキットは、定向進化のプロセスを介して誘導された第2世代（2G）酵素を含みます。KAPA2G FAST HotStart DNAポリメラーゼは、より高い処理能力とスピードを目標として設計された抗体介在型ホットスタート製剤であり、伸長速度が野生型Taq DNAポリメラーゼよりも大幅に速くなっています。KAPA2G Fastは、スピードに加えて、競合酵素よりも高い収率と感度で高度なマルチプレックスPCRを行うことができます*。

KAPA2G Fast Multiplexでできること：

• すべてのアンプリコンの均一な提示
• 増幅困難なGCリッチな標的のマルチプレックスPCRの成功
• PCRサイクリング時間の最大60%短縮
• わずか15秒の短い伸長時間
• パフォーマンスを損なわずに高速
• マスターミックス製剤により最適化は最小限

図3. *KAPA2G Fast Multiplex PCRキット、競合品Q、競合品Iを用いて実施したマルチプレックスPCR（8-plex）。反応液（25 μL）には、等倍PCRマスターミックス（KAPAおよび競合品Q）または等倍PCR緩衝液、3 mM MgCl2、0.2 mMの各dNTP、1 UのホットスタートTaq DNAポリメラーゼ（競合品Iによる自家製マルチプレックス試薬）を含む。ヒトゲノムDNAをテンプレートとして用い（反応1回あたり250～2 ng）、プライマーは各0.2 μMで提供した。サイクリングはメーカーの推奨に従って実施した（30サイクル）。

図4. *KAPA2G Fast Multiplex PCRキット、競合品Q、競合品Iを用いて実施したマルチプレックスPCR（12-plex）。複雑なマルチプレックスアッセイにおいてすべてのアンプリコンを均一に提示することは、アンプリコンの長さ、二次構造、プライミング効率の違いによる増幅バイアスがあるため困難。反応液（25 μL）には、等倍PCRマスターミックス（KAPAおよび競合品Q）または等倍PCR緩衝液、3 mM MgCl2、0.2 mMの各dNTP、1 UのホットスタートTaq DNAポリメラーゼ（競合品Iによる自家製マルチプレックス試薬）を含む。ヒトゲノムDNAをテンプレートとして用い（反応1回あたり250～2 ng）、プライマーは各0.2 μMで提供した。サイクリングはメーカーの推奨に従って実施した（30サイクル）。

図5. Fast Multiplex PCRキットによるKAPA2G Fast Multiplex PCR。野生型Taqを用いたマルチプレックスPCRは、一般に、プライマーのアニーリングおよびマルチプレックス中のすべてのプライマーの伸長を可能にするために、長いアニーリング時間と伸長時間を必要とする。KAPA2G Fast Multiplex PCRキットおよび競合品QのマルチプレックスPCRキット（野生型Taq DNAポリメラーゼを含む）を用いた4-plex、8-plex、12-plexのマルチプレックスPCR（メーカーの推奨に従って30サイクルに設定）に必要なPCRサイクルの合計時間を示している。KAPA2G Fast Multiplex PCRキットにより、40～60%の時間短縮が可能。

図6. KAPA2G Fast Multiplex PCRキット、競合品Q、競合品Iを用いたGCリッチのマルチプレックスPCR（6-plex）。野生型Taqを用いたマルチプレックスPCRの成功は、同等の効率で増幅できる容易かつ単純な標的に限られる。改変KAPA2G Fast DNAポリメラーゼにより処理能力が向上したため、幅広い増幅困難な標的の均一なマルチプレックスPCRが可能になっている。反応液（25 μL）には、等倍PCRマスターミックス（KAPAおよび競合品Q）または等倍PCR緩衝液、3 mM MgCl2、0.2 mMの各dNTP、1 UのホットスタートTaq DNAポリメラーゼ（競合品Iによる自家製マルチプレックス試薬）を含む。ヒトゲノムDNAをテンプレートとして用い（反応1回あたり250～2 ng）、プライマーは各0.2 μMで提供した。DMSO（5%）およびKAPA Enhancer 1（等倍）をすべての反応液に添加した。サイクリングはメーカーの推奨に従って実施した（30サイクル）。アンプリコンの大きさは241～642 bp、GC含量は72.7～83.8%。

KAPA2G Robust DNAポリメラーゼ

KAPA2G Robust DNAポリメラーゼは、広範な種類のアンプリコン（GCリッチおよびATリッチ）における安定しない増幅を解決するために開発されました。この製品は処理能力が高く、活性が特異的であるため、ロバストなPCR性能、高感度、一般的な阻害物質に対する耐性の改善が実現しています。この高性能キットは、難しいPCRアプリケーションや増幅困難なサンプルに理想的であり、複数の酵素やプロトコルを用いた最適化の必要性を排除します。

KAPA2G Robust DNAポリメラーゼでできること：

• 単位酵素あたりの収率が高いことが要求されるアプリケーション
• コロニーPCR
• 阻害物質のキャリーオーバーに対する耐性および未精製サンプルのPCR（例：FFPE）
• HotStartまたはReadymix製剤を用いたルーチンPCR

GCリッチおよびATリッチな標的の効率的な増幅：

• 幅広いGCおよびATリッチテンプレートにおけるロバストな性能
• PCR成功率の上昇

図7. この試験で用いた96のプライマーセットのうち72セットから得られたPCR産物のそれぞれ半分を、1%TBE-アガロースゲルで電気泳動。アンプリコンはGC含量が増加する順にローディングし、各複合ゲル画像の左上に最も低いGC含量（27%、青色）、右下に最も高いGC含量（84%、赤色）とした。さまざまなプライマー長、配列組成、理論的融解温度、その他の設計上の特徴があるプライマーを選択。プライマーの中には、M13またはその他の標準的な配列決定プライマーを用いるPCR後シーケンシング用の5'-テイルを含むものもあった。A. KAPA2G Robust HotStart ReadyMix反応（25 μL）を、ユーザーガイドに記載のとおりに実施。B. 野生型Taq反応（25 μL、1回の反応あたり0.5 UのTaqを含む）は、Taq反応緩衝液（1.5 mM MgCl2、等倍）中で、KAPA2G Robustと同じ最終プライマーおよびdNTP濃度を用いて実施。

すべての反応液には25 ngのヒトゲノムDNAが含まれました。GC含量が70%超のアンプリコンを標的とするすべての反応（KAPA2G RobustおよびTaq）には5%のDMSOを添加しました。

一般的なPCR阻害物質に対する耐性の改善

• 未精製サンプルからの効率的な増幅
• 酵素1単位あたりの収率および感度が向上

図8. 4種類の一般的なPCR阻害薬の存在下でのKAPA2G Robust HotStart PCRキットおよび野生型ホットスタートTaqポリメラーゼを用いた1 pgプラスミドDNAからの1.5 kbフラグメントの増幅。すべての反応で、反応液25 μLあたり0.5単位の酵素を含んだ。SDSを含む反応にはKAPA2G Robust HotStart Buffer Bを使用し、KAPA Enhancer 1を添加した。標準的な3段階サイクリングプロファイル（35サイクル）を用いて、Eppendorf Mastercycler epgradient Sでサイクリングを実施した。すべての酵素についてアニーリング温度は64ºC、1サイクルあたりの伸長時間は1.5分でした。

コロニーPCRにおける無類の性能

• 大腸菌および酵母細胞で直接実施されるPCRの収率の向上と一貫性の改善

図9. 一般に使用されている4種類の大腸菌株（DH5a、DH10B、JM109、BL21）からクローニングされた2.7 kbの挿入断片を、KAPA2G Robust HotStart（上）または野生型Taq（下）を用いて増幅。コロニー（LB寒天+Ampプレート上で増殖）を個々のPCR反応液に直接再懸濁する（左）か、最初にPCRグレードの水に再懸濁した後、PCR反応ミックスに添加した（中央）。一晩培養（LB+Ampで調製）するために、1 μLをPCRミックスに直接添加しました（右）。

図10. 一般に使用されている3種類のS. cerevisiae株（BY4742、FY23、W303）のGSH1遺伝子からクローニングされた2.5 kb（左）または1.6 kb（右）のフラグメントを、KAPA2G Robust HotStart（上）または野生型Taq（下）を用いて増幅。コロニー（YPD寒天プレート由来）またはYPD一晩培養物を、最初に50 μL容量のNaOHまたはザイモラーゼ（図示）で溶解した。

KAPA Long Range PCR System

KAPA Long Range PCR Systemは、Taq DNAポリメラーゼと、プルーフリーディング性能がある改変古細菌（Bファミリー）DNAポリメラーゼのブレンドです。この2酵素系は、ロングレンジPCRおよび／または高感度PCRをサポートするように特別に設計されており、フィデリティはTaqポリメラーゼよりも3～4倍高くなっています。このホットスタート処方では、KAPA Long Rangeを独自の抗体と組み合わせることで最初の変性段階まで酵素を不活性化し、偽増幅産物を排除して反応効率と感度を高めます。

KAPA Long Range PCRキットは以下に理想的です：

• 長い標的のPCR増幅および／または少量のテンプレートDNAを用いたPCR
• 標準的なショートレンジおよびミドルレンジのPCR増幅
• 3'-Tオーバーハングクローニングベクターへのライゲーションに使用するPCR産物の作成

利点：

• 高感度・高特異性で最大15 kbの標的を増幅
• 少量のDNAで高収率
• 競合他社のロングレンジ用システムが失敗した場合にも高収率、高感度、高特異性を発揮*

図11. 25 μLあたり50 ng、10 ng、2 ng、400 pgから開始するヒトゲノムDNAテンプレート希釈液の増幅。アンプリコンの長さは737 bp、1.3 kb、3.3 kb、4.5 kb。72ºCの伸長温度で35サイクル。

図12. 25 μLあたり50 ng、10 ng、2 ng、400 pgから開始するヒトゲノムDNAテンプレート希釈液の増幅。アンプリコンの長さは7.5 kb、10.5 kb、13 kb、15 kb。68ºCの伸長温度で35サイクル。

図13. *25 μLあたり50 ng、10 ng、2 ng、400 pgのヒトゲノムDNAから4.5 kbのフラグメントを増幅。レーン：（M）マーカー、（1～4）KAPA Long Range HotStart、（5～8）競合品T、（13～16）競合品R。

KAPA Mouse Genotyping

1時間以内にテイルからタイプへ。

KAPA Mouse Genotypingキットは、マウス組織からDNAフラグメントを信頼性の高い方法で1時間以内に抽出・増幅できるように設計されています。従来のプロトコルではこの作業に1日以上かかっていました。キットには、マウス組織からPCR対応のDNAをわずか15分で抽出できる新規の熱安定性プロテアーゼ・緩衝液系であるKAPA Express Extractと、高い処理能力と究極のスピードを目標とする進化により作製されたDNAポリメラーゼを含むKAPA2G Fast Genotyping Mix with dyeが含まれています。

KAPA Mouse Genotypingキットでできること：

• 15分間の抽出で有機溶媒の除去、pHの中和、遠心分離を可能に
• 45分間の増幅で高い処理能力と究極のスピードを実現
• ホットスタート処方と非ホットスタート処方の両方にローディング色素を添加した便利なマスターミックスフォーマット

未精製抽出法や市販キットよりも優れている

• 所要時間の短縮と特異性の向上
• コスト削減

図14 および 図15. Quanta Mouse Genotypingキットと比較して、KAPA Mouse Genotypingキットは、マルチプレックスPCRにおいて優れた感度、収率、特異性を示す。ジェノタイピングアッセイにおいて至適以下のアニーリング温度を使用した効果を実証するために、50℃または60℃のいずれかでのアニーリングにより反応を行った。

処理能、ターンアラウンドタイム、信頼性の向上

• わずか15分でPCR対応DNAを作製
• 取扱いは最小限で、サンプルの不足や汚染のリスクが低減
• 複数のアッセイに十分量のテンプレート；96ウェルフォーマットでサンプルを取り扱うために容易にスケール変更可能
• アンプリコン長およびGC含量が幅広いDNAフラグメントの迅速かつ信頼性の高い増幅

図16 および 図17. A）DNA抽出・増幅に要した総時間を、KAPA Mouse Genotyping Kitキット、プロテイナーゼK、野生型Taq、ならびにアルカリ溶解および野生型Taqを用いて比較。B）KAPA Mouse Genotypingキット（1）を用いて作製した5つのアンプリコン（312～915 bp）の結果を、一般に使用されている2つのメソッド（2および3）で得られた結果と比較。KAPA Mouse Genotypingキットを用いて、迅速な（15分）シングルチューブKAPA Express Extractシステムによりマウス尾部からDNAライセートを調製した。KAPA2G Fast HotStart ReadyMix with dyeによる増幅は45分で完了した。対照的に、DNAライセートの調製はプロテイナーゼKプロトコル（2）で約3.5時間または迅速アルカリ溶解法（3）で約2.5時間を要した。いずれの場合も野生型Taqを用いて増幅を行った（1.5時間サイクリングプロトコル）。KAPA Mouse Genotyping キットを用いて得られた結果は、他のメソッド（使用する正確なDNA抽出プロトコルに応じて）で得られた結果と同等またはそれ以上（より特異的）であった。他のメソッドでは完了までに少なくとも4倍の時間がかかる場合もあれば、最長1日を要する場合もあった。

KAPA Express Extract

迅速かつ効率的なDNA抽出

KAPA Express Extractは、PCR対応DNAをわずか15分で抽出できる新規の熱安定性プロテアーゼ・緩衝液系です。DNA抽出は1本のチューブで簡便に実施できるため、サンプルの不足や汚染のリスクが大幅に低減します。KAPA Express ExtractとKAPA2G Robust HotStart ReadyMixを組み合わせることで、迅速なDNA抽出と一貫した下流増幅のための高性能なソリューションが得られます。

KAPA Express Extractでできること：

• 迅速抽出プロトコルでPCR対応DNAを15分以内に作製できるため、増幅困難なサンプルタイプでも一貫した下流増幅が可能
• 多用途・最適化キットにより口腔スワブ、毛包、魚組織、鳥の羽毛などのさまざまなサンプルおよび組織型からのDNA抽出が成功
• シングルチューブ反応により汚染のリスクが最小限に
• 「Guthrie」カード、FTA®Eluteカード、FTAカードからの効率的な抽出

図18 および 図19. 哺乳類および魚類由来のさまざまなサンプルから、KAPA Express Extractを用いてDNAを抽出。各抽出物から2 μLを、KAPA2G Robust HotStart ReadyMixと、種の同定に一般に使用される約650 bpのチトクロームCオキシダーゼI遺伝子フラグメントのプライマーを含むPCR反応液に直接（定量せず）使用した（Ivanova, et al., 2007）。PCR産物（10 μL）を1%アガロースゲルで分析した。サンプルの起源と種類はゲルの上に表示されている。反応産物を直接用いて、ネストされていないM13プライマーを用いた標準的なサンガーシーケンシング反応（10 μLのシーケンシング反応液につき2 μLのPCR産物）を行った。配列データは質が高く、各動物種の同定が可能。Seriola lalandi（ヒラマサ）組織由来の配列トレースの一部を下図に示す。

図20. 2つの異なるFFPEサンプルからKAPA Express Extractを用いてDNA抽出物を調製。各抽出物を直接（定量せずに）用いて、KAPA2G Robust HotStart ReadyMixとEGFR遺伝子の5つの異なるフラグメント（293 bp～1 kb）のプライマー（エクソン18～21および24に対応）を含む複数のPCRを行った。その結果を、精製したヒトゲノムDNA 1 ngをテンプレートとして用いて同じ反応条件・サイクル条件で得られた結果と比較した。古いサンプルの1 kbのエクソン24フラグメントを除いて、収率および反応効率は、FFPE DNA抽出物と精製ゲノムDNAで同等だった。サンプル1から作製したPCR産物を1:10に希釈し、標準的なサンガーシーケンシング反応に直接使用した。配列データ（下図、サンプル1エクソン19フラグメント）は高品質だった。矢印でマークした位置から開始する混合配列により、サンプル1を採取した患者において診断された非小細胞癌に関連する15-nt欠失の存在が確認された。

図21. HLA-B*27対立遺伝子検出のためのさまざまな血液サンプル型からのDNAの抽出と増幅。12個のヒトEDTA血液サンプルからKAPA Express Extractを用いてDNAを抽出した（上図）。各抽出物2 μLを、KAPA2G Robust HotStart ReadyMixと2つのプライマーセットを含むPCR反応液25 μLに直接添加した。内部標準プライマーセットはβグロビン遺伝子の429 bpフラグメントを標的とし、2つめのプライマーセットはHLA-B*27遺伝子座の141 bpフラグメントを配列特異的に標的とする。12例中2例が、強直性脊椎炎に関連するHLA-B*27対立遺伝子陽性を示した。レーンC-およびC+は、それぞれHLA-B*27陰性および陽性対照を示している（テンプレートとして精製ヒトゲノムDNA 1 ng）。HLA-B*27陽性（+）または陰性（-）であることが確認されている患者の血液をスポットした「Guthrie」カード、FTAカード、またはFTA Eluteカード（下図）からDNAを抽出した。DNA抽出・増幅の条件および対照（C-およびC+）は上図と同じ。

KAPA3G Plant PCRキット

KAPA3G Plant PCRキットは、植物由来DNAのPCRに用いる精製DNAまたは未精製抽出DNAのいずれかを用いるように設計されています。キットには、ポリフェノール類や多糖類などの一般的な植物由来PCR阻害物質に対する耐性を改善するように設計されたKAPA3G DNAポリメラーゼが含まれています。

KAPA3G Plant PCRキットでできること：

• リーフディスク、種子、未精製植物抽出物などの植物組織から直接行う高速PCR
• 遺伝子変異スクリーニングの合理化ワークフロー
• PCR成功率と再現性の改善

ワークフローの合理化と所要時間の短縮

• 野生型酵素と比較してPCRを半分の時間で実施可能
• 時間のかかるDNA抽出の必要性を排除
• 直接PCRに最適

図22. KAPA3G Plant PCRキットを用いた直接PCRは、CTAB抽出および野生型Taqを用いた標準PCRよりも優れており、所要時間も大幅に短縮された。

未精製サンプルや精製DNAから長鎖の標的を増幅

• 最大5 kbのフラグメントを増幅
• 高い収率および特異性

図23. KAPA3G Plant PCRキットを用いて、さまざまな長さの標的（タバコ由来の297 bpと4100 bp、トマト由来の640 bp、ブドウの木由来の1221 bp、ジャガイモ由来の1448 bpと2249 bp）を精製DNA（+）またはリーフディスク（L）から増幅。各植物種について、市販のDNA精製キットを用いてゲノムDNAを精製した。未精製材料は、0.5 mm径のHarris Uni-Core ^TMサンプリングツールを用いて採取した。精製DNA（1～10 ng/反応、種により異なる）および未精製サンプルをPCR反応液50 μLのテンプレートとして用い、40サイクルの増幅を行った。反応産物を1%アガロースゲルで解析しました。KAPA Express DNA Ladder（100、200、400、800、1600、4000、8000 bp）を分子量マーカーとして使用した。

多様な植物種および組織型により直接PCRを実施

• リーフディスクまたは種子をテンプレートとする直接PCR
• 時間のかかるDNA抽出は不要

図24. すべての植物種のゲノムDNAを市販のDNA精製キットを用いて精製。Harris Uni-Core™サンプリングツール（直径0.5 mm）を用いて、葉（すべての種）または種子（タバコおよびシロイヌナズナを除くすべての種；これらについては、1回の反応につき1個の粉砕種子を使用）を採取した。PCR反応液（50 μL）には未精製サンプルまたは1～10 ngの精製DNA（種により異なる）が含まれており、いずれの場合も40サイクルの反応を実施した。標的は500～900 bpであり、反応産物を1%アガロースゲルで分析した。分子量マーカーとして、KAPA Express DNA Ladder （100、200、400、800、1600、4000、8000 bp）を用いた。

未精製サンプル植物に対する新しいPCRワークフローにより成功率を改善

• 抽出緩衝液を用いて植物PCR用未精製抽出物をわずか5分で調製
• 最も増幅困難な種類のサンプルでも高い成功率

図25 8種類の植物の葉および／または種子について、熱処理を行わずに調製した未精製抽出物1 μL（左）または熱処理を行った未精製抽出物1 μL（右）を用いて、Tab c/dプライマーペアを用いた未精製サンプルのPCRを実施。反応はKAPA3G Plant PCR Kit TDSに記載のとおりに設定し、1サイクルにつき55℃でのアニーリングおよび72℃・20秒間の伸長で構成されるPCR反応を45サイクル行った。KAPA Express DNA Ladder（100、200、400、800、1600、4000、8000 bp）を分子量マーカーとして使用した。1：ユーカリ；2：ブドウの木；3：コムギの葉；4：コムギの種子；5：カノーラの葉；6：カノーラの種子；7：イネの種子；8：オオムギの種子；9：トウモロコシの穀粒；10：ワタの種子；11：ワタの葉。