DNase Iリコンビナント、RNaseフリープロトコル

製品番号04716728001

プロトコル

RT-PCR反応物からのDNA除去

概要

ウシ膵臓由来DNase Iは、分子量37,000の糖タンパク質です。DNaseからRNaseを除去するには特殊な手順が用いられます。DNase Iは、DNAに特異的なエンドヌクレアーゼであり、dsまたはssDNAを加水分解しオリゴヌクレオチドおよびモノヌクレオチドの混合物を産生します。この酵素は、最大活性を得るために二価カチオンを必要とします。反応の特異性は用いるカチオンの性質によって決まります。Mg²⁺存在下でDNase IはdsDNAに切れ目を入れ、Mn²⁺存在下で二重鎖を切断します。

RT-PCRで推奨されるDNA除去法

10 x反応バッファー：200 mM Tris-HCl（pH 8.3）、500 mM KCl、10 mM MnCl₂に、20 UのプロテクターRNaseインヒビター添加を推奨します；
1 UのDNase I、RNaseフリー/1 μg total RNAを添加し、+25℃で30分インキュベーションします。

フェノール/クロロホルム抽出液により反応を停止した後、エタノール沈殿を実施します（あるいは、+75℃で5分間加熱により反応を停止しますが、温度上昇によりRNAを損傷する可能性があるので注意します）。

注釈：one-tube RT-PCR

Mn²⁺バッファーおよび酵素の除去は、Titan-One-Tube RT-PCRシステムを用いたワンステップRT-PCRにおいて反応の妨害の回避に必要です。この場合、代替法の使用が可能です：

1. 40 mM Tris（pH 8）、10 mM MgSO₄、1mM CaCl₂に1 μg RNAを溶解します。
2. 6 UのDNase I、RNaseフリーおよび20 UのプロテクターRNaseインヒビターを添加します。
3. 37℃で1時間インキュベーションします。

90℃で5分不活化し、短時間の遠心分離により沈降させ、速やかに氷上でインキュベーションします。