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Marcatura e modificazione di proteine

Marcatura fluorescente e modificazione di proteine

Le proteine sono composte da catene polipeptidiche e le loro funzioni biologiche sono in buona parte determinate dal corretto ripiegamento, dalla dimensione e dal numero di gruppi funzionali reattivi presenti lungo tali catene. La capacità di introdurre delle modifiche in siti specifici delle proteine consente ai ricercatori di indagare su svariate proprietà e sulla funzione biologica globale delle proteine stesse. Le tecnologie di marcatura e di modifica delle proteine ​consistono nell'aggiunta di fluorofori, biotina e di altre piccole molecole che permettono di studiare le interazioni proteina-proteina, il corretto ripiegamento, la struttura complessiva e la funzione biologica delle proteine stesse. 



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Marcatura fluorescente di proteine

La proteina fluorescente verde (GFP) che, dopo essere stata scoperta, ha visto un'ampia diffusione del suo impiego in studi biologici, rappresenta un efficace esempio di questa tecnologia. La GFP e le sue varianti hanno avuto un enorme impatto in numerosi campi di studio e nella comprensione dei processi biologici. Ad esempio, l'incorporazione di etichette fluorescenti (tag) sugli anticorpi consente la rilevazione e la quantificazione di complessi proteici nei tessuti con elevata specificità ed è ampiamente utilizzata nei complessi anticorpo-proteina in applicazioni quali l’ELISA e il western blot. Per contro, uno svantaggio significativo dell'utilizzo della GFP consiste nel fatto che la funzionalità di una proteina può venire alterata dall'incorporazione di tag proteici di queste dimensioni. Per evitare questo inconveniente, i ricercatori possono utilizzare tag fluorescenti più piccoli rispetto alla GFP, la biotina o, ancora, incorporare amminoacidi non naturali con funzionalità biortogonale.

Coniugazione di proteine con enzimi

L'incorporazione di enzimi o sonde specifiche è un altro metodo utilizzato dai ricercatori per marcare le proteine. Le coniugazioni enzima-proteina più comuni utilizzano la fosfatasi alcalina (AP) e la perossidasi di rafano (HRP). L'utilizzo di tecnologie di marcatura enzima-proteina offre numerosi vantaggi; esse, infatti, consentono l'amplificazione del segnale, la possibilità di ottenere segnali di diversa natura e la disponibilità di numerosi substrati tra cui scegliere per ciascun enzima. Per rilevare il segnale dell'attività dell'enzima legato alla proteina solitamente si fa ricorso a tecniche di misurazione della fluorescenza, della chemiluminescenza o colorimetriche. La varietà della natura di questi segnali consente di utilizzare la coniugazione con enzimi in applicazioni di immunoistochimica (IHC) o di immunofluorescenza (IF) nelle cellule e nei tessuti.

Tecnologie emergenti per la marcatura delle proteine

Nel campo della ricerca sulle malattie e della scoperta di nuovi farmaci, la tecnologia della degradazione proteica mirata costituisce un settore di studio all’avanguardia per identificare nuovi bersagli farmacologici e potenziali terapie. La tecnologia della proteolisi mirata mediata da chimera si avvale di molecole bifunzionali capaci di legarsi con un'estremità alla proteina bersaglio specifica della malattia e con l'altra a una ligasi E3 che eliminerà così la proteina indesiderata dalle cellule. La specificità di queste molecole verso un'ampia gamma di bersagli specifici di stati patologici, combinata alla capacità di indirizzarli verso la proteolisi sfruttando i normali sistemi di degradazione proteica delle cellule, le rende una potente tecnologia di marcatura delle proteine per la ricerca sulle malattie.

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