本操作程序适用于胶原酶产品。
连续分光光度法测定（A345，光路= 1 cm）基于以下条件：
FALGPA = N-（3- [2-呋喃基]丙烯酰基）-Leu-Gly-Pro-Ala
FAL = N-(3[2-呋喃基]丙烯酰基）-Leu
单位定义 – 当钙离子存在时，在25℃、pH 7.5的条件下，一单位的胶原酶每分钟可水解1.0 µmol的FALGPA。
所需试剂和设备
- Tricine（货号T0377）
- 5.0 M氯化钠溶液（货号S6546）
- 1 M氢氧化钠溶液（货号S2567）
- 1 M氯化钙溶液（货号21115）
- 1 M盐酸溶液（货号H3162）
- FALGPA（货号F5135）
注意事项
请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。
制备说明
使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。
缓冲液（含10 mM氯化钙和400 mM氯化钠的50 mM Tricine，25 °C时pH 7.5）– 在一合适的烧杯中称重~2.24 g的Tricine（货号T0377）。加入200 mL的超纯水。加入20 mL的5.0 M氯化钠溶液（货号S6546）。充分混匀并使用1-5 M NaOH或HCl将pH调整为25 °C时7.5。在完成pH调整后，加入25 mL由货号21115制备而来的100 mM氯化钠溶液。加入纯净水至终体积为250 mL。如果需要，可使用1-5 M NaOH或HCl将pH调整为25 °C时7.5。
FALGPA（1.0 mM N-（3- [2-呋喃基]丙烯酰基）Leu-Gly-Pro-Ala） – 在缓冲液中使用N-(3[2-呋喃基]丙烯酰基）-Leu-Gly-Pro-Ala（货号F5135）制备校正的0.48 mg/mL（1.0 mM）溶液。基于所用特定批次的FALGPA水含量对浓度进行校正。搅拌至少30分钟以完全溶解。如果需要，可用1 M氢氧化钠溶液（货号S2567）或1 M盐酸溶液（货号H3162）将pH调整为25 °C时7.5。
酶溶液 – 在立即将要使用前在冷的（2–8 °C）超纯水中制备含2单位/ml胶原酶的溶液。
操作流程
在3.00 mL的反应混合液中，终浓度为48.3 mM tricine、9.67 mM氯化钙、387 mM氯化钠、0.967 mM FALGPA和0.20单位胶原酶。
1.将以下移液至合适的容器中：
2.倒置混合，并在适当恒温的分光光度计中平衡至25 °C。
3.然后添加：
4.立即颠倒混匀并记录A345的下降~5分钟。采用至少一分钟的间隔以及至少4个数据点来获得针对所有检测以及空白对照的最大线性率（ΔA345/分钟）。
结果
计算
1.
| 单位/ml酶 = | （ΔA345/分钟 检测 – ΔA345/分钟 空白） (3.00) (df) | |
| (0.53) (0.10) |
式中：
3.00 = 反应混合物的总体积（ mL）
df = 稀释因子
0.53 = 基于实验测定的345 nm处FALGPA的毫摩尔消光系数。它与在345 nm处FALGPA的每毫摩尔吸光度的最大下降值直接相关。
0.10 = 所用酶溶液的体积（mL）
2.
| 单位/mg固体 = | 单位/ml酶 | |
| mg固体/mL酶 |
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