逆转录实验方案

使用ReadyScript cDNA合成(RDRT) 试剂进行逆转录的实验方案

将组分放于冰上。混合，然后短暂离心以收集管底部的内容物。

试剂	20 μL反应的用量	终浓度
ReadyScript cDNA合成混合物(RDRT)	4 μL	1X
RNA模板	不定	1μg至10总RNA
不含RNA酶/DNA酶水	不定
总体积	20 μL

注意：反应体积更小或更大时，组分应按比例缩小或增加

反应

• 将试剂加入0.2 mL微型离心管或96孔板中，并置于冰上。
• 对各反应密封后，轻轻涡旋混合内容物。短暂离心，收集反应管底部的组分。
• 孵育：
  • 25 °C，5 min
  • 42 °C，30 min
  • 85 °C，5 min
  • 4 °C 保温
• 完成cDNA合成后，使用第一链反应的1/5至1/10（2-4μL）进行PCR扩增。如果需要，可以用10 mM Tris-HCl（pH8.0），0.1 mM EDTA稀释cDNA产物并储存在-20℃。

逆转录指南—qPCRMinus RT对照：

RT-qPCR精确定量基因表达需要针对每个目标基因，对每份RNA样品中的基因组DNA污染进行定量。痕量gDNA存在通常不会干扰高拷贝数参考基因定量，但可对低拷贝数基因信号产生显著影响。即使使用由内含子序列或桥接外显子连接分开的引物，基因组DNA的存在也可以通过假基因或脱靶PCR产物的扩增而产生阳性信号。因此，在实验设计中始终包含适当的“无RT”或“阴性RT”对照反应十分重要。

由于逆转录酶是ReadyScript cDNA合成混合物的组成组分，因此单独构建不含RT的合成混合物作为对照是不可行的。检测基因组DNA存在的最直接方法是绕过RT步骤并直接使用等量RNA制备物进行PCR扩增。例如：如果您从1μg总RNA开始进行cDNA合成，并使用1/10的第一链反应产物作为qPCR模板；然后使用100 ng总RNA作为阴性RT对照qPCR模板。在仅有RNA的对照组中，任何信号都可作为存在基因组DNA的依据。

总RNA的DNA酶消化：

如果痕量水平的基因组DNA干扰了靶标基因准确定量，请使用高质量、无RNase的DNase I制剂去除残留基因组DNA（DNAse I，货号AMPD1-1KT）。在DNase酶消化后，必须在进行第一链合成前去除所有痕量DNase酶活性。适宜的RNA纯化方法包括苯酚:氯仿提取，乙醇沉淀，或离液盐和基于二氧化硅的RNA纯化管或柱（GenElute™ Direct mRNA Miniprep试剂盒，货号DMN10）。简单的“加热杀菌”步骤或灭活浆状溶液与ReadyScript cDNA 合成混合物不兼容。

相关定义

cDNA - 互补DNA（cDNA）是来自单链RNA或信使RNA（mRNA）模板并由逆转录酶生成的一种DNA拷贝。cDNA可通过DNA聚合酶而转化为DNA。与其模板RNA或mRNA一样，cDNA仅包含整个基因组的某些片段，并可用于研究特定基因的表达。cDNA文库是通常按基因组织而成的cDNA集合。