如何计算DNA的Tm?
寡核苷酸的解链温度（Tm）是指50％寡核苷酸与其完美互补链构成双链体，而另外50％游离于溶液中的温度。Tm对于分子生物学中的许多技术都极为重要（如PCR、Southern blotting、原位杂交等）。这些传统技术中的一些仍然广泛地与更新的技术结合使用，例如用于下一代测序中的基于PCR的样品文库制备。
确定Tm的最常用实验方法是测量寡核苷酸及其互补链作为温度函数的吸光度变化（图1）。虽然实验确定的Tm值是最准确的，但在常规应用中使用传统分子技术时，这些值不是必需的。
图 1.寡核苷酸Tm的实验测定示例用UV-Vis分光光度计在恒温槽中进行测量。Tm是双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）曲线上平台之间中间的读数。
式中：
Tm = 解链温度，单位为℃
ΔH = 焓变，单位为kcal mol-1（退火/解链过程中的能量变化）
A = 常数，为-0.0108 kcal K-1 ᐧ mol-1（退火/解链过程中的螺旋起始）
ΔS = 熵变，单位为kcal K-1 ᐧ mol-1（无法工作（即无序）的能量）
R = 气体常数，为0.00199 kcal K-1 ᐧ mol-1（针对温度按比例调节能量的常数）
C = 寡核苷酸浓度，单位为M或mol L-1（我们使用0.0000005，即0.5 μM）
-273.15 = 转换因子，用于将预期的K氏温度转换为°C
[Na+] = 钠离子浓度，单位为M或mol L-1（我们使用0.05，即50 mM）
对于ΔH、ΔS和A，存在有限数量的最邻近值，其 可以直接插入上述公式中（表1）。
表1.ΔH和ΔS的最邻近值。在作为基本最邻近公式（参考文献1）来源的论文中，ΔS、A和R 以cal K-1 ᐧ mol-1为单位，因此公式用因子1,000乘以ΔH（以kcal mol-1为单位）来平衡单位。然而，这里我们以kcal K-1 ᐧ mol-1作为ΔS、A和R的单位，因此每个参数的单位匹配，使得下面的计算示例在量纲分析中更直观。无论采用哪种方法，计算的Tm都是相同的。如需ΔH和ΔS值的完整列表，包括摆动序列），请通过oligotechserv@sial.com联系我们的技术服务小组。
*左序列是5'至3'，而右序列是3'至5'，例如对于AA/TT，AA为5'至3'，TT为3'至5'。选择值时，始终在5'至3'的方向选择，无论正确方向中是左还是右序列。
** 负值表明退火是焓和熵有利的。正值反映逆反应（解链），Tm 计算相同。
最邻近法计算示例。此示例将演示如何手动计算下列序列的Tm：
5'-AAAAACCCCCGGGGGTTTTT-3'
这是上述序列的反向互补链：
5'-AAAAACCCCCGGGGGTTTTT-3'
3'-TTTTTGGGGGCCCCCAAAAA-5'
第一步：找出ΔH和ΔS的最邻近值，并对每个参数求和。
读取靶序列5'至3'，所有最邻近点的ΔH和ΔS值可以在表1中找到。所找到的最邻近点对及其ΔH和ΔS值（及总和）如下：
第二步：将值插入最邻近法公式中以计算解链温度
Tm = 69.6 °C
作为比较，这是由我们的在线寡核苷酸序列计算器确定的值：
手动计算的69.6与OligoEvaluator™的计算值69.7非常吻和（差异是因为在这个计算示例中，原始文献中气体常数1.987四舍五入为1.99）。
在此寡核苷酸随附的技术数据说明书中，将显示数值69.7。
基本方法
我们用来计算Tm的第二种方法是基本方法（修正的Marmur Doty公式3），我们将其用于具有短序列长度的寡核苷酸，即14个碱基或更少的寡核苷酸。该方法部分来自于膜杂交实验，它假定引物浓度为50 nM，单价离子（Na+）浓度为50 mM，pH为7.0。尽管膜杂交实验现在不像几十年前最初进行该研究时那样经常进行，但PCR等更现代的技术还在使用这种计算方法，在计算中使用了一个校正因子来修正可能游离于溶液中的寡核苷酸。
我们使用以下修正过的Marmur Doty公式计算：
Tm = 2(A + T) + 4(C + G) - 7
式中：
Tm = 解链温度，单位为℃
A = 序列中腺苷核苷酸的数量
T = 序列中胸苷核苷酸的数量
C = 序列中胞苷核苷酸的数量
G = 序列中鸟苷核苷酸的数量
-7 = 溶液的校正因子
Marmur Doty计算示例。此示例将演示如何手动计算下列序列的Tm：
5'-ACGTCCGGACTT-3'
第一步：将值插入Marmur Doty公式中以计算解链温度。
Tm = 2(A + T) + 4(C + G) - 7
Tm = 2(2 + 3) + 4(4 + 3) - 7
Tm = 31.0 °C
作为比较，这是由我们的在线寡核苷酸序列计算器确定的值：
参考文献
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