Optimierung der qPCR-Bedingungen
Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.
Ein Ansatz zur Assay-Optimierung besteht darin, die optimale Hybridisierungstemperatur (Ta) der Primer zu bestimmen, indem identische Reaktionen mit einer feststehenden Primer-Konzentration über einen ganzen Bereich von Hybridisierungstemperaturen getestet werden. Dies kann erreicht werden, wenn ein qPCR-Gerät mit einem Temperaturgradientenblock zur Verfügung steht. In dem in diesem Protokoll vorgestellten Format sind die Primer in einer Endkonzentration von 450 nM enthalten und der Gradient ist quer zur X-Achse des Blocks so ausgerichtet, dass alle Spalten der gleichen Ta ausgesetzt sind (d. h. 12 verschiedenen Temperaturen). Bei anderen Geräten verläuft der Gradient entlang der Spalte, sodass alle Zeilen den gleichen Ta-Wert aufweisen (d. h. 8 unterschiedliche Temperaturen). Das folgende Protokoll kann, wenn auch mit geringfügigen Änderungen, auf beide angewandt werden.
Ausrüstung
- Gerät für die quantitative PCR mit integrierter Gradientenblock-Kontrollfunktion
- Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional)
Reagenzien
- cDNA 1:5-1:10 verdünnt, gDNA 10 ng, synthetisches Oligo (10.000 Kopien) oder anderes geeignetes Template zur Optimierung.
- KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03; gerätespezifisch, siehe Tabelle P17-42).
- Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden.
- Konzentrierte Stammlösung für Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM Arbeitslösung: GOI).
- Kundenspezifische Oligos können unter sigmaaldrich.com/oligos bestellt werden.
| Hot Start ReadyMixes (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2) | |||
|---|---|---|---|
| KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, Art.-Nr. KCQS00 | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , Art.-Nr. KCQS01 | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX, Art.-Nr. KCQS02 | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ, Art.-Nr. KCQS03 |
| Kompatible Geräte: | Kompatible Geräte: | Kompatible Geräte: | Kompatible Geräte: |
| Bio-Rad CFX384™ | Applied Biosystems 7500 | Applied Biosystems 5700 | Bio-Rad iCycler iQ™ |
| Bio-Rad CFX96™ | Applied Biosystems 7500 | Applied Biosystems 7000 | Bio-Rad iQ™5 |
| Bio-Rad MiniOpticon™ | Fast Applied Biosystems ViiA 7 | Applied Biosystems 7300 | Bio-Rad MyiQ™ |
| Bio-Rad MyiQ™ | Stratagene Mx3000P® | Applied Biosystems 7700 | |
| Bio-Rad/MJ Chromo4™ | Stratagene Mx3005P™ | Applied Biosystems 7900 | |
| Bio-Rad/MJ Opticon 2 | Stratagene Mx4000™ | Applied Biosystems 7900 HT Fast | |
| Bio-Rad/MJ Opticon® | Applied Biosystems 7900HT | ||
| Cepheid SmartCycler® | Applied Biosystems StepOnePlus™ | ||
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex | Applied Biosystems StepOne™ | ||
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s | |||
| Illumina Eco qPCR | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 | |||
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q | |||
| Roche LightCycler® 480 | |||
Materialien
- Sterile Filter-Pipettenspitzen
- Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)
- PCR-Röhrchen und -Platten. Treffen Sie ihre Auswahl, um das gewünschte Format zu erhalten:
• Einzelne dünnwandige 200 μl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
• Platten
- 96-Well-Platten (Z374903)
- 384-Well-Platten (Z374911)
• Plattendichtungen
- ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)
- ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)
Anmerkungen zu diesem Protokoll
- Die cDNA wird mit Hilfe eines Zufallsprimers oder einer Oligo-dT-Priming-Methode erzeugt und für die Verwendung 1:10 verdünnt. Es kann alternativ jedes geeignete Template eingesetzt werden.
- Alle Reaktionen werden in doppelter Ausführung als technische Replikate durchgeführt.
- Wenn Sie eine PCR-Platte verwenden, folgen Sie einem Plattenschema (z. B. in Abbildung P14-19), um sicherzustellen, dass die Reaktionsmischung, die Proben und die Kontrollen in die richtigen Wells gegeben werden.
Methode
1. Vorbereitung eines Mastermix für 56 Reaktionen gemäß Tabelle P14-35. Gut mischen, damit keine Blasen entstehen.
| Reagenzien | Volumen (μl) pro 20 μl-Einzelreaktion | Volumen (μl) für 56 Reaktionen |
|---|---|---|
| KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 2x | 10 | 560 |
| Vorwärtsprimer (10 μM) | 0,9 | 50,4 |
| Rückwärtsprimer (10 μM) | 0,9 | 50,4 |
| Wasser in PCR-Qualität | 4,2 | 235,2 |
2. Entnehmen Sie 448 μl des Mastermix aus Schritt 1 (d. h. die Hälfte) in ein separates Röhrchen für den Aufbau der NTC-Reaktionen (Negativkontrolle).
3. Fügen Sie 112 μl des Templates zum restlichen Mastermix aus Schritt 2 hinzu. Legen Sie das Mastermix des Templates auf Eis.
4. Fügen Sie der anderen Hälfte des Mastermix aus Schritt 2 112 μl Wasser hinzu. NTC-Mastermix auf Eis legen.
5. Aliquotieren Sie 20 μl-Mastermix des Templates aus Schritt 3 in zwei Reihen der PCR-Platte mit der Bezeichnung GOI.
6. Aliquotieren Sie 20 μl NTC-Mastermix aus Schritt 4 in zwei Reihen der PCR-Platte mit der Bezeichnung NTC.
7. Platten abdecken und beschriften. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt)
8. Lassen Sie die Proben gemäß dem nachstehenden dreistufigen Protokoll durchlaufen (Hinweis: Diese Bedingungen sind spezifisch für FAST-Zyklusprotokolle). Durch sie wird sichergestellt, dass die Hybridisierungstemperatur auf einem Gradienten zwischen der niedrigsten und der höchsten Temperatur, welche für die Primer geeignet ist, definiert wurde (Beispiel: 54-70 °C). Die Schritte 1-3 werden in 40 Zyklen wiederholt. Nach der Amplifikation wird eine Standard-Dissoziationskurve erstellt.
| FAST-Zyklusbedingungen | Temp. (ºC) | Zeit (s) |
|---|---|---|
| Anfängliche Denaturierung/Hot Start | 95 | 30 |
| Die Schritte 1-3 werden in 40 Zyklen wiederholt. | ||
| Schritt 1 | 95 | 5 |
| Schritt 2 | 54-70 (Gradient) | 15 |
| Schritt 3 | 72 | 10 |
Hinweis: Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung).
Abbildung P14-19.Plattenlayout für Ta-Optimierung mit identischem Ta für jede Spalte.
Hinweis: Die Verteilung der Proben und Kontrollen über den Temperaturgradienten. Wenn das Gerät über einen Temperaturgradienten verfügt, der vertikal über den Plattenverlauf variiert, müssen die Proben und Kontrollen entsprechend neu angeordnet werden.
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