Plasmid-DNA-Aufreinigung

Einführung in die Plasmidaufreinigung

Die Extraktion von Makromolekülen wie DNA, RNA und Proteinen ist in der molekularbiologischen Forschung üblich. Der Extraktions- und Aufreinigungsprozess von Nukleinsäuren hat sich von einem komplexen und arbeitsintensiven Verfahren weiterentwickelt. Die aktuellen Nukleinsäureaufreinigungsverfahren bieten eine hohe Probenausbeute, Reinheit und Skalierbarkeit von Biomolekülen bei minimaler Kreuzkontamination. Üblicherweise werden auch automatisierte Systeme verwendet, die für mittelgroße bis große Labore entwickelt wurden.

Nukleinsäuren für die Plasmidaufreinigung vorbereiten

Die Vorbereitung von Nukleinsäuren beginnt mit dem Prozess der Probennahme (Bakterien, Tiergewebe und -zellen oder Pflanzengewebe). Durch die geeignete Entnahme und Handhabung der Proben wird, unabhängig von dem Verfahren, das für die DNA-Aufbereitung verwendet wird, eine Nukleinsäure mit hoher Qualität erzielt. Der Weg von der Probennahme zur Nukleinsäureaufreinigung kann Probennahme, Transport, Archivierung, Lagerung und Aufreinigung von Nukleinsäuren als Arbeitsablauf einschließen (Abb. 1).

Abbildung 1. Arbeitsablauf für Probennahme, Transport, Archivierung und DNA-Aufreinigung.

Nukleinsäurenisolation

Die Isolation von DNA involviert die Lyse von Zellmembranen, das Entfernen von Histonproteinen, RNA und Lipiden sowie die Aufreinigung. In Tabelle 1 werden verschiedene verfügbare Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen veranschaulicht.

Tabelle 1.Überblick über Verfahren für die Nukleinsäurenisolation

Verfahren	Merkmale
Konventionelles Verfahren
Alkalisches Extraktionsverfahren (PLED35)	alkalische Denaturierung von chromosomaler DNA mit hoher Molekülmasse wird zum Isolieren von Plasmid-DNA eingesetzt  Rückgewinnungsprozess nach dem Zentrifugieren
Cäsiumchlorid(CsCl)-Dichtegradientenzentrifugation	präparative Dichtegradientenultrazentrifugation von DNA wird zum Isolieren von Plasmid-DNA eingesetzt die aufgereinigte Nukleinsäure muss mit Alkohol erneut ausgefällt werden
Oligo(dT)-Cellulose-Chromatografie	Aufreinigung von RNA große Mengen RNA aus Säugetierzellen
Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion (30911)	einstufige Flüssig-Flüssig-Extraktion, die zum Extrahieren von RNA aus kultivierten Zellen und den meisten Tiergeweben eingesetzt wird erzeugt in vier Stunden eine hohe Ausbeute der Folgeprozess wird durch Ausfällung mit Isopropanol durchgeführt
Festphasen-Nukleinsäureextraktion
Kieselgelmatrizen*	für die DNA-Bindung und DNA-Aufreinigung aufgereinigte DNA-Moleküle können später unter geringer Ionenstärke (pH-Wert ≥ 7) eluiert werden, indem Tris-EDTA-Puffer oder destilliertes Wasser verwendet wird
Glasteilchen	zum Trennen der Nukleinsäure von anderen Stoffen in Gegenwart von chaotroper Salzlösung
Diatomeenerde (Kieselgur oder Diatomit)	nützlich für die Aufreinigung von Plasmid und anderer DNA, indem die DNA in Gegenwart eines chaotropen Mittels auf Teilchen immobilisiert wird DNA wird mit einem Niedrigsalzpuffer oder in destilliertem Wasser eluiert
Anionenaustauschmaterial	Wechselwirkung zwischen positiv geladenen Diethylaminoethylcellulose-Gruppen (DEAE) auf der Harzoberfläche mit negativ geladenen Phosphaten des DNA-Gerüsts
* GenElute-Produkte

Plasmid-DNA

Plasmide sind kleine, kreisförmige, doppelsträngige DNA, die in der Molekularbiologie zum Manipulieren und Dekodieren von genetischen Informationen eingesetzt werden. Sie haben sich zu Schlüsselkomponenten in allen Klonierungs- und biotechnologischen Techniken entwickelt, da sie leichter zu verändern sind.

Verschiedene Verfahren für die Plasmid-DNA-Aufreinigung wurden entwickelt. Wir verpflichten uns, Ihnen umweltfreundlichere Alternativprodukte anzubieten, die einen oder mehrere der „12 Grundsätze der Grünen Chemie“ erfüllen. Die GenElute-Produkte weisen eine inhärent sicherere Chemie auf, verglichen mit der gängigen Verwendung von Phenol und Chloroform, um DNA-Extraktionen durchzuführen.

Das GenElute™ Plasmid-Miniprep-Kit ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Kulturen. Das Kit kombiniert eine Membrantechnologie auf Siliziumdioxidbasis mit der Annehmlichkeit eines Spinsäulenformats und gewinnt je ml Übernachtkultur bis zu 20 mg Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl. Folgende sind die Hauptschritte (Abb. 2) der Isolation und Aufreinigung von Plasmid-DNA mit dem GenElute™ Plasmid-Miniprep-Kit.

1. Bakterienzellen werden mittels Zentrifugieren geerntet, einem modifizierten alkalischen SDS-Lyseverfahren unterzogen und die DNA in Gegenwart einer hohen Salzkonzentration auf Siliziumdioxid adsorbiert.
2. Verunreinigungen werden anschließend durch einen einfachen Waschschritt entfernt.
3. Die gebundene DNA wird in Wasser oder Tris-EDTA-Puffer eluiert. Die gewonnene Plasmid-DNA liegt überwiegend in ihrer Supercoiled-Form vor.
4. Die DNA ist für die Verwendung in Anwendungen wie Restriktionsenzymverdau, Klonen, PCR-Umwandlung, Transkription, konventionelle und automatisierte Sequenzierung bereit.

Einige unserer Plasmid-DNA-Aufreinigungskits sind in Tabelle 2 aufgelistet. Detaillierte Erklärung der verschiedenen Plasmid-DNA-Aufreinigungsverfahren (PDF)

Abbildung 2. Arbeitsablauf für die Nukleinsäurenaufbereitung und -aufreinigung aus Plasmiden. PCR-DNA-Reinigung: Produktnummern NA1020 und PCR9604

Tabelle 2.Plasmid-DNA-Aufreinigungskits

Produkt-Nr.	Produktname	Merkmale
PLN10 PLN70 PLN350	GenElute™ Plasmid-Miniprep-Kit	Aufreinigung von bis zu 20 µg Plasmid-DNA je ml Kultur aufgereinigte Plasmid-DNA in weniger als 30 Minuten für bis zu 24 Aufbereitungen schneller als Schwerkraftfluss-Anionenaustauschsäulen nicht nachweisbare DNA- oder RNA-Kontamination es ist keine Phenol-/Chloroformextraktion oder Alkoholausfällung erforderlich enthält zusätzlichen Waschpuffer zur Verwendung mit enda+ E. coli-Bakterienstämmen (z. B. hb101, jm101, bl21)
NA0150S NA0150 NA0160   NA0200S NA0200 NA0300S NA0300 NA0310	GenElute™ HP Plasmid-Miniprep-Kit	von der geernteten Bakterienkultur zu reiner Plasmid-DNA in 30 Minuten oder kürzer bis zu 25 µg (mini), 350 µg (midi) und 1,2 mg (maxi) Ausbeute von Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl bietet die Flexibilität eines Vakuum- oder Spinformats es ist keine Phenol-/Chloroformextraktion oder Alkoholausfällung erforderlich die Kits sind bei Raumtemperatur stabil, wodurch sie praktisch zu lagern sind kostengünstig
PLED35	GenElute™ endotoxinfreies Plasmid-Midiprep-Kit	Aufreinigung von bis zu 250 mg endotoxinfreier Plasmid-DNA (≤ 0,1 EU/μg DNA) schnell und einfach; ermöglicht bis zu 12 Aufbereitungen in weniger als 2 Stunden schneller als Schwerkraftfluss-Ionenaustauschsäulen oder magnetische Bead-Aufbereitungen keine teure magnetische Ausrüstung erforderlich
NA0500	GenElute™ HP Plasmid-Megaprep-Kit	hochentwickelt – die neueste Technologie gewährleistet eine verbesserte Leistung reichhaltig – erzeugt 5 mg hochwertige, endotoxinfreie (≤ 0,1 EU/μg) Plasmid-DNA in 90 Minuten oder kürzer praktisch – Vakuumformat, das keine Ethanolausfällung erfordert
NA0400S NA0400 NA0410	GenElute™ HP endotoxinfreies Plasmid-Maxiprep-Kit	schnell – von der geernteten Bakterienkultur zu reiner Plasmid-DNA in 40 Minuten flexibel – das praktische Vakuumformat verwendet keine Schwerkraftfluss-Säulen hohe Ausbeuten – bis zu 1,2 mg Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl und ≤ 0,1 EU/μg
NA0600	GenElute™ HP endotoxinfreies Plasmid-Megaprep-Kit	schnell – von der geernteten Bakterienkultur zu reiner Plasmid-DNA in 90 Minuten praktisch – Vakuumformat, das keine Ethanolausfällung erfordert hohe Ausbeuten – bis zu 5 mg Plasmid-DNA (≤ 0,1 EU/μg)
NA0800	GenElute™ HP Select Plasmid-Gigaprep-Kit	hochentwickelt – verwendet die HP-Select-Technologie, das führende Plasmidaufreinigungsverfahren hohe Ausbeuten – 15 mg hochwertige, endotoxinfreie (≤ 0,1 EU/μg) Plasmid-DNA in 2 Minuten oder kürzer praktisch – Vakuumformat, das keine Ethanolausfällung erfordert vielseitig – kann verwendet werden, um Plasmid-DNA mit geringer, mittlerer und hoher Kopienzahl aufzureinigen
NA0100	PhasePrep™ BAC-DNA-Kit	typische DNA-Ausbeute von 2–100 µg aus 5–500 ml Übernachtkulturen keine Phenol-/Chloroformextraktion erforderlich ermöglicht mögliche Mikro-zu-maxi-Aufbereitungen mit demselben Kit

Tabelle 3.PCR-Reinigungsprodukte

Produkt-Nr.	Produktname
NA1020	GenElute™ PCR-Reinigungskit
PCR9604	GenElute™ 96-Well-PCR-Reinigungskit

Literatur

1. Tan SC, Yiap BC. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 20091-10. https://doi.org/10.1155/2009/574398

2. Buckingham L, Flaws ML. 2007. Flaws, Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods, & Clinical Applications. Philadelphia, USA: F.A. Davis Company.

3. Weaver R. 2002. Molecular Biology . 2nd edition. San Francisco: McGraw Hill.