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Oligonukleotidhandhabung und -stabilität

DNA-Oligonukleotide sind relativ stabile Moleküle (Tabelle 1). Sie erfordern jedoch bestimmte Handhabungs- und Lagerungstechniken, um einen problemlosen Ablauf von Experimenten bzw. maximale Haltbarkeit zu gewährleisten.

Tabelle 1. Ungefähre Haltbarkeit von nicht modifizierten, einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden bei geeigneter Lagerung. Diese Werte sind Schätzungen und werden nicht garantiert.

Resuspension, Lagerung und Arbeitsgewohnheiten

Nicht modifizierte DNA

Resuspension. Sofern kein Versand in Lösung beantragt wird, werden alle einzelsträngigen DNA-Oligonukleotide trocken versandt und sind nach einer Resuspension gebrauchsfertig. Thiol-modifizierte Sequenzen bilden die Ausnahme (befolgen Sie dieses Reduktionsprotokoll, um diese Oligonukleotide zu aktivieren). Schwache Puffer wie TE (10 mM Tris, pH-Wert 7,5 bis 8,0, 1 mM EDTA) oder Tris (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) sind zu bevorzugen, wobei TE die beste Wahl ist. Sollte TE sich nicht für die Endtechnik/-anwendung eignen, ist steriles, nukleasefreies Wasser die zweitbeste Wahl.

Aufbewahrung. Wie in Tabelle 1 dargestellt, bietet eine Aufbewahrung bei -20 °C die längste Haltbarkeitsdauer. TE-Puffer stellt die mit Abstand beste Option dar, da Wasser in Laborqualität oft leicht sauer ist, wodurch die DNA langsam zersetzt wird. Außerdem sind trockene Oligos nie wirklich trocken. Es bleibt immer etwas Feuchtigkeit zurück, was wiederum zu einer langsamen Zersetzung führt. Über mindestens 2 Jahre ist ein signifikanter Unterschied bei der Haltbarkeit jedoch unwahrscheinlich, unabhängig davon, ob sie trocken, in Wasser oder in Puffer gelagert werden.

Nicht modifizierte RNA

Resuspension. Einzelsträngige RNA-Oligonukleotide sollen, wie weiter oben für nicht modifizierte DNA beschrieben, resuspendiert werden.

Aufbewahrung. RNA ist aufgrund ihrer chemischen Struktur deutlich weniger stabil als DNA. RNA wird einer Autokatalyse (Abb. 1) sowie einer Zersetzung durch RNasen unterzogen, die z. B. in Quellen wie abgestoßenen Hautzellen und allgegenwärtigen Mikroorganismen in Laboren reichlich vorhanden sind.

RNA-Autokatalyse

Abbildung 1. RNA-Autokatalyse.Die 2‘-Hydroxylgruppe von RNA kann zur autokatalytischen Zersetzung führen, die unter den richtigen Bedingungen wiederum die Menge der verwendbaren Oligonukleotide senkt.

Für die Kurzzeitlagerung sollen einzelsträngige RNA-Oligonukleotide bei -80 °C in TE-Puffer aufbewahrt werden. Für die Langzeitlagerung ist eine Aufbewahrung bei -80 °C als Ethanolausfällung die beste Option. Vorkehrungen zum Minimieren der Aussetzung gegenüber RNasen verlängern die Haltbarkeit.

Arbeiten mit RNA. RNasen enthalten oft zahlreiche Disulfidbindungen und sind daher sehr stabil. Diese Enzyme sind resistent gegenüber gängigen Dekontaminationsverfahren wie Autoklavieren und lassen sich nur durch den Einsatz von aggressiven Chemikalien entfernen. Die folgenden Vorkehrungen helfen dabei, die Aussetzung Ihrer RNA-Oligonukleotide gegenüber RNase zu minimieren:

  • Nehmen wir an, dass alles an Ihrem Arbeitsplatz/in Ihrem Labor mit RNasen kontaminiert ist.
  • Nutzen Sie einen isolierten Teil des Labors, an dem nur mit RNA gearbeitet wird.
  • Reinigen Sie den RNA-Isolationsbereich regelmäßig mit Mitteln, die RNasen zerstören.
  • Verwenden Sie Chemikalien, Reagenzien und Wasser, die als RNase-frei zertifiziert sind.
  • Nutzen Sie Werkzeuge wie Mikropipetten, die nur für die Arbeit mit RNA verwendet werden.
  • Tragen Sie immer Handschuhe und wechseln Sie diese, nachdem Sie andere Oberflächen berührt haben.

Modifizierte Oligonukleotide

Resuspension. Modifizierte Oligonukleotide, entweder DNA oder RNA, sollen in TE-Puffer resuspendiert werden. Dies ist wichtig, insbesondere für fluoreszierende Einheiten, da der pH-Wert einen großen Einfluss auf die Intensität der Fluoreszenzemission haben kann.

Aufbewahrung. Modifizierte Oligonukleotide sollen ähnliche Stabilitätsprofile wie ihre nicht modifizierten DNA- und RNA-Pendants aufweisen. Deshalb sollen sie gemäß den vorgenannten Empfehlungen für DNA und RNA aufbewahrt werden. Um eine Photobleichung zu verhindern, sollen fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide im Dunkeln aufbewahrt werden.

Arbeiten mit Fluoreszenzmodifikationen. Um bei der Arbeit mit fluoreszierenden Einheiten eine Photobleichung zu verhindern, sollen diese in ihren Braunglasröhrchen belassen oder, falls sie in transparente Röhrchen übertragen werden, in Aluminiumfolie gewickelt werden.

Duplex-Oligonukleotide

Unsere Wissenschaftler fanden heraus, dass siRNA-Duplexe mindestens 3 Jahre stabil sind, wenn sie trocken bei -20 °C aufbewahrt werden. DNA-Duplexe sollen genauso stabil, wenn nicht sogar stabiler sein. (Dieser Wert ist eine Schätzung und wird nicht garantiert. Um ein experimentell bestimmtes Verfallsdatum mit einer Garantie zu erhalten, fragen Sie bitte eine Stabilitätsstudie [nachstehend] an.).

Einweg-Aliquote

Es wird angenommen, dass Gefrier-Auftau-Zyklen genomische DNA zersetzen, wahrscheinlich durch Scheren aufgrund von Eiskristallbildung.1 Unsere Wissenschaftler fanden jedoch heraus, dass Oligonukleotide durch derartige Zyklen nicht negativ beeinflusst werden. Dennoch ist das Aufteilen der Oligonukleotide in Aliquote für den Einmalgebrauch und das anschließende Gefrieren bei -20 °C immer noch das bewährteste Verfahren. Hierdurch wird Abfall aufgrund von Pannen wie Kreuzkontamination oder Verschütten vermieden. Wenn Sie beispielsweise Ihr einziges Röhrchen mit Oligonukleotid auf den Boden verschütten, müssen Sie ein neues bestellen. Wenn Sie jedoch nur ein einzelnes Aliquot auf den Boden verschütten, können Sie einfach ein weiteres Röhrchen auftauen.

Lösungen vorbereiten

Die Oligonukleotidmenge, die sowohl auf dem Röhrchenetikett als auch auf dem technischen Datenblatt steht, wird in verschiedenen Einheiten angegeben, darunter optische Dichte (OD), Mikrogramm (µg; in der Folge µg/OD) und Nanomol (nmol). Unser Quantifizierungsverfahren beginnt mit einer Absorbanzmessung bei 260 nm in einem UV/VIS-Spektralphotometer, um einen OD-Wert bereitzustellen. Alle anderen Einheiten werden von diesem OD-Wert abgeleitet (um mehr zu erfahren, siehe Oligonukleotidquantifizierung). Diese Mengeneinheiten (nmol ist die nützlichste) können direkt verwendet werden, um Stammlösungen herzustellen.

Es gibt viele Einheiten für die Konzentration, aber Mikromolar (µM) ist für Nukleotide die wahrscheinlich am häufigsten verwendete Einheit. Ausgehend von der bereits bestimmten nmol-Menge, die auf dem Röhrchenetikett/technischen Datenblatt steht, werden hier sowohl ausführliche als auch kurze Berechnungen als Beispiel bereitgestellt, die für die Herstellung einer 100-µM-Stammlösung sowie einer 10-µM-Arbeitslösung erforderlich sind. Verwenden Sie für schnellere Ergebnisse, einschließlich der Berechnung der Konzentration in anderen Einheiten, die Resuspensions- und Verdünnungsmodule von OligoEvaluator™.

Beispielhafte ausführliche Resuspensionsberechnung

Wir arbeiten lieber mit Basiseinheiten, um „Umwandlungsverwirrung“ während der Dimensionsanalyse zu vermeiden. Es passieren leicht Fehler, wenn versucht wird, direkt zwischen nmol, µM und anderen Untereinheiten der Basiseinheiten umzurechnen.

Schritt 1. Umwandeln der Anzahl von nmol auf dem Röhrchenetikett/technischen Datenblatt in Mol.

Unser hypothetisches Oligonukleotid wird in einer Menge von 49,9 nmol geliefert.

mol = 49,9 nmol x 1 mol 109 nmol-1

mol = 4,99 x 10-8
 

Schritt 2. Umrechnung der gewünschten Stammlösungskonzentration von 100 µM in Stoffmengenkonzentration.

100 µM = 100 µmol l-1

M (mol l-1) = 100 µmol l-1 x 1 mol 106 mol-1

M (mol l-1) = 1 x 10-4
 

Schritt 3. Verwenden der gewünschten Stammlösungskonzentration als Stoffmengenkonzentration und der Anzahl von Mol, um das für die Resuspension erforderliche Volumen in Litern zu berechnen.

1 x 10-4 mol l-1 = 4,99 x 10-8 mol

l = 4,99 x 10-8 mol / 1 x 10-4 mol

l = 4,99 x 10-4
 

Schritt 4. Umrechnen von Litern in Mikroliter (µl).

Volumen = 4,99 x 10-4 l x 106 µl-1

Volumen = 4,99 µl
 

Beispielhafte kurze Resuspensionsberechnung

Schritt 1. Multiplizieren der Anzahl von nmol auf dem Röhrchenetikett/technischen Datenblatt mit 10, um das Resuspensionsvolumen in Mikrolitern zu erhalten.

Volumen = 49,9 nmol x 10

Volumen = 499 µl

Diese kurze Berechnung funktioniert nur für die Herstellung von 100-µM-Lösungen.

Geben Sie in diesem bestimmten Fall 499 µl Wasser oder Puffer in das Röhrchen, das die Oligonukleotide enthält und vortexen Sie es, um ein ausreichendes Mischen zu gewährleisten.

Weitere Anmerkungen zur Resuspension

Im vorstehenden Resuspensionsbeispiel werden 100 µM verwendet, da dies eine typische Konzentration für Laborstammlösungen ist. Die Herstellung von Stammlösungen mit Konzentrationen von deutlich weniger als 100 µM kann problematisch sein, da das für die Resuspension erforderliche Volumen die 2-ml-Kapazität des Röhrchens leicht übersteigen kann. Um beispielsweise eine 20-µM-Stammlösung herzustellen, müssten zu diesem bestimmten Oligonukleotid, das in 49,9 nmol vorliegt, 2,49 ml Wasser oder Puffer zugegeben werden.

Ebenso kann das Herstellen von Stammlösungen mit einer Konzentration von mehr als 100 µM problematisch sein. Um beispielsweise eine 1000-µM-Stammlösung herzustellen, müssten zu diesem bestimmten Oligonukleotid 49,9 µl Wasser oder Puffer zugegeben werden. Dieses geringe Volumen akkurat aus einem 2-ml-Röhrchen zu pipettieren kann eine Herausforderung darstellen.

Um eine 100-µM-Stammlösung herzustellen, sind keine Berechnungen und Online-Tools nötig, da das erforderliche Volumen für die Resuspension auf dem technischen Datenblatt steht.

Beispielhafte Berechnung der Arbeitslösung

In diesem Beispiel gehen wir davon aus, dass die endgültige 10-µM-Arbeitslösung in einem für PCR typischen Volumen von 20 µl vorliegen soll.

Schritt 1. Verwenden dieser Konzentration in der Volumenäquivalenzformel.

C1V1 = C2V2

100 µM x V1 = 10 µM x 20 µl

V1 = 2 µl

In diesem Fall geben Sie 2 µl der Stammlösung in das Reaktionsgefäß, fügen die anderen Komponenten hinzu und füllen mit Wasser oder Puffer auf ein Endvolumen von 20 µl auf.

Mengenprüfung

Wir lassen größte Sorgfalt walten, um sicherzustellen, dass unsere OD-Werte korrekt sind. Vielleicht möchten Sie die Menge Ihres Oligonukleotids dennoch selbst verifizieren. Wenn Sie über ein traditionelles UV/VIS-Spektralphotometer verfügen, ist das Verfahren einfach.

Führen Sie folgende Schritte durch:

  1. Resuspendieren Sie das Oligonukleotid in 400 µl Wasser oder Puffer.
  2. Verdünnen Sie 12 µl in 988 µl sterilem, nukleasefreiem Wasser.
  3. Messen Sie den A260-Wert von 1 ml Probe in einer Küvette.
  4. Stellen Sie sicher, dass der OD-Wert im linearen Bereich (~0,1 bis 1 OD) liegt.
  5. Multiplizieren Sie den OD-Wert des Probevolumens mit dem Verdünnungsfaktor.
    Gesamt-OD = OD von 1 ml Probe x 400/12
  6. Multiplizieren Sie die Gesamt-OD mit µg/OD (aus dem technischen Datenblatt), um µg zu erhalten.

Schlussfolgerung

Selbst bei einer schlechten Behandlung sind die meisten einzelsträngigen DNA-Oligonukleotide stabil genug, um bei einer Verwendung kurz nach der Lieferung gut zu funktionieren. Falls Sie zusätzliche Hilfe benötigen, wenden Sie sich bitte unter oligotechserv@sial.com an unseren technischen Dienst.

Literatur

1.
Roder B, Fruhwirth K, Vogl C, Wagner M, Rossmanith P. 2010. Impact of Long-Term Storage on Stability of Standard DNA for Nucleic Acid-Based Methods. Journal of Clinical Microbiology. 48(11):4260-4262. https://doi.org/10.1128/jcm.01230-10
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