Optimalizace pro vysoce výkonnou analýzu kanabinoidů v různých matricích pomocí kolony Ascentis^® Express C18

Seamus Riordan-Short, Senior Chemist¹, Yevgen Kovalenko, Technician¹, Matthew Noestheden, Director of Operations¹, Jennifer King, Program Marketing Manager², Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison²

¹Supra Research and Development, ²Merck

 Article from Analytix Reporter - Issue 11

S rostoucím počtem právních předpisů týkajících se konopí a konopí se zvýšila poptávka po vývoji a validaci přesných a precizních testovacích metod pro kvantifikaci síly. Kanabinoidy představují řadu výzev a navíc se k nim přidává zátěž spojená s různými typy matric. Nejčastěji používanou technikou je HPLC/UV a parametry HPLC musí být optimalizovány tak, aby byla zachována dobrá separace a stabilní retence po mnoho vstřiků a u různých typů vzorků.

Vědci ze společnosti Supra Research and Development ("SupraRnD") se sídlem v Kelowně v Britské Kolumbii v Kanadě (www.suprarnd.ca) vyvinuli vysoce výkonnou a spolehlivou metodu pro stanovení kanabinoidů, která je použitelná pro různé matrice. Zapojení společnosti SupraRnd do testování konopí začalo v roce 2015, kdy získala licenci od kanadského ministerstva zdravotnictví na testování konopných produktů. V roce 2018 jako jedna z prvních laboratoří v Kanadě získala akreditaci ISO 17025 pro testování konopí. Jejich metoda testování účinnosti se v průběhu času vyvíjela, aby vyhovovala měnícím se potřebám zákazníků, a nyní je validována pro několik různých matric.

Experimentální podmínky

Vzorky celých květů byly zmrazeny v hermeticky uzavřených sáčcích při teplotě -80 °C po dobu minimálně 30 minut a poté ihned homogenizovány.^* Při analýze květu konopí je velmi důležité homogenizovat reprezentativní vzorek a odebrat dílčí vzorky, protože mezi jednotlivými rostlinami i v rámci dané rostliny mohou být značné rozdíly v koncentraci fytokanabinoidů. Následný pracovní postup zahrnoval jednoduchou extrakci vzorku o velikosti 0,2 g methanolem, po níž následovala sonikace a stabilizace extraktu při -20 °C po dobu 1 hodiny. Poté byl vzorek odstředěn a supernatant zředěn v poměru 100:1 pro HPLC analýzu. Malá velikost vzorku v kombinaci s ředěním před analýzou minimalizuje možnost problémů souvisejících s matricí (např. interference, životnost kolony atd.). Doba cyklu analýzy HPLC je 8 minut od vstřiku do vstřiku. To umožňuje 60 vstřiků za 8hodinový interval, což umožňuje provést více vzorků od zákazníků během pracovní směny. Kanabinoidy analyzované touto metodou jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1. 17 Fytokanabinoidy separované metodou HPLC (podle pořadí eluce).

CBDVA CBDV CBDA <.li>CBGA

CBG /li> CBD THCV THCVA

CBN CBNA Δ9-THC Δ8-THC

CBL CBC THCA CBCA CBLA

HPLC analýza kanabinoidů

Konečné optimalizované parametry HPLC jsou shrnuty v tabulce 2.

Při vývoji této metody byly brány v úvahu následující faktory:

• Chromatografické rozlišení všech 17 sloučenin.
• Celková doba (tj, doba běhu plus ekvilibrace) celkem méně než 10 minut.
• Robustní metoda s konzistentním výkonem pro
• >1000 nástřiků se stabilními retenčními časy při zachování dobrého tvaru píku a odezvy.
• Vhodná pro použití s různými matricemi, jako jsou květiny, čokoláda, mast, olej, koncentrát atd.

Tabulka 2. Optimalizované parametry metody HPLC

Column	Ascentis® Express C18, 15 cm × 2.1 mm I.D, 2 μm (50814-U)
Mobilní fáze A	5 mM mravenčan amonný + 0.1% kyselina mravenčí ve vodě
0.1% kyselina mravenčí v acetonitrilu
70% B na 90% B za 3 min; udržení na 90% B po dobu 2 min; na 98% B za 0.1 min; hod na 98 % B po dobu 0,9 min; na 70 % B za 0,1 min; držení na 70 % B po dobu 0,9 min
Průtoková rychlost	0.4 ml/min
Tlak	533 barů
30 ˚C
Detektor	UV, 228 nm
Injekce	25 μl
Vzorky	Metanolový extrakt ze vzorků získaných z konopí (olej, koncentrát, mast atd.)

Kalibrace metody

Kalibrace metody byla v rozsahu od 0,01 µg/ml do 40 µg/ml. To vyžadovalo vysoké ředění některých vzorků, aby se dostaly do tohoto analytického rozsahu. Pro kalibraci a spikování byly použity certifikované referenční materiály (CRM) Cerilliant^®. Jednotlivé kanabinoidní CRM v koncentraci 1 mg/ml (s výjimkou CBLA v koncentraci 0,5 mg/ml) byly naředěny spolu s roztokem vnitřního standardu přímo do mobilní fáze HPLC složky A, aby se připravil 17složkový zásobní roztok v koncentraci 40 µg/ml. Tento zásobní roztok byl poté dále naředěn do směsi mobilních fází HPLC A:B v poměru 30:70 pro kalibrační standardy s nižší koncentrací.

Kolona HPLC: Ascentis^® Express C18

 Kolona HPLC použitá pro analýzu byla kolona Ascentis^® Express C18, 15 cm x 2,1 mm I.D., 2 µm. Kolony Ascentis^® Express obsahují částice Fused-Core^® s pevným jádrem a porézní architekturou pláště, označované také jako povrchově porézní. Tato struktura částic poskytuje vyšší separační účinnost než plně porézní částice stejné velikosti a umožňuje kratší dobu analýzy s nižším protitlakem než přístupy využívající menší (< 2 µm) plně porézní částice. Architektura částic kolon Ascentis^® Express umožňuje použití větších částic, takže jsou vhodné pro konvenční i UHPLC systémy. Pro tuto metodu společnost SupraRnD použila systém UHPLC, ačkoli při správné optimalizaci přístroje lze úspěšné separace dosáhnout i na konvenčních systémech. Konkrétně by to znamenalo minimalizovat disperzi systému. Toho lze dosáhnout zmenšením délky a ID hadiček na vstupu a výstupu kolony a u UV detektorů použitím průtokové cely o objemu < 5 µl.

Validace metody a výkonnost

Před výběrem kolony Ascentis^® Express C18 pro validaci metody společnost SupraRnD provedla screening šesti dalších kolon s podobným chemickým složením od různých výrobců. S několika kolonami se jim podařilo dosáhnout chromatografického rozlišení a krátké doby chodu, ale zjistili, že Ascentis^® Express C18 je jediná kolona, která poskytuje stabilitu retenčního času - zejména pro kyselé kanabinoidy. To je znázorněno na obrázku 1, který ukazuje chromatogramy kontrolního standardu při nástřiku č. 1 a nástřiku č. 1140, mezi nimiž byly provedeny četné extrakty vzorků.

Obrázek 1. Standard kanabinoidů na koloně Ascentis^® Express C18; srovnání nástřiku č. 1 a nástřiku č. 1140.

Metoda s použitím přístroje Ascentis^® Express C18 byla validována v několika různých matricích včetně chmelových květů (jako náhradní matrice konopí), konopného oleje, koncentrátu CBD a lokálních mastí. Výtěžnost z chmele se pohybovala v rozmezí 85-115 % v rozmezí 0,05 až 20 % hmotnostních. Shrnutí této validace, stejně jako ostatních matric, je uvedeno v tabulce 3. Dosažené limity pro vykazování metody (MRL) pro kanabinoidy (s výjimkou CBDV, CBG, CBD a CBC v koncentrátu) byly všechny 0,05 % hmot. Opakovatelnost vyjádřená v % RSD byla u všech matric 4 %. Další hodnocení bylo provedeno pomocí zkoušek způsobilosti, při nichž metoda úspěšně prošla u vzorků konopného květu a konopného oleje.

Tabulka 3. Shrnutí údajů o validaci metody pro kanabinoidy v několika matricích

	Rozsah výtěžnosti všech 17 kanabinoidů naočkovaných do matrice			RSDr	MRL (wt%)
Hladina špikování (wt%)	0.05%	1%	20%
Chmel (náhradní matice)	86-106	96-115	100.5-116	<1,5 %	0.05
Olej z konopných semen	92-118	104-116	101.5-113	<4%	0.05
Mast 1						anbsp;
(izolát CBD)	83-120*	80-122*	--	<3%	0.05
Mast 2	86-117**	--	<2.5%	0.05
CBD koncentrát	71-123.5*	92-118*	--	<3.5%	0,05Ŧ

^{* výtěžnostCBD nebyla kvantifikována z důvodu vysokých vzniklých hladin
**výtěžnostΔ9-THC nebyla kvantifikována z důvodu vysokých vzniklých hladin
ŦCBDV, CBG, CBD, CBC vzniklé v matrici vedly k problémům bránícím výpočtu MRL pro tyto sloučeniny}

Obrázek 2 ukazuje příklady chromatogramů chmelových květů s příměsí 1 % hm. a s koncentrací MRL 0.05 % w/w.  Při mnohem nižší hladině spikování, kde se více projevovala interference matrice, bylo všech 17 kanabinoidů rozeznatelných od píků pozadí a bylo je možné analyzovat. Specifické interference eluující vedle THCV a CBL byly pravděpodobně způsobeny specifickými terpeny přítomnými ve vzorku chmele. Tyto píky nebyly v květu konopí pozorovány. Ve vzorku kořeněné masti (obrázek 3) byly všechny kanabinoidy jasně detekovány na úrovni MLR.

Obrázek 2. Květy chmele s 1% přídavkem kanabinoidů.

Květy chmele s 0,05 % kanabinoidů.

Obrázek 3. Mast z konopného extraktu s příměsí 0,05 % hmotnostních.

Do dnešního dne bylo na jediné koloně Ascentis^® Express C18 provedeno 1 550 vstřiků. Společnost SupraRnD zaznamenala, že dosud nedošlo k žádnému významnému zvýšení protitlaku kolony ani ke zhoršení výkonu. Údaje shromážděné o protitlaku v průběhu tohoto používání ukázaly čisté zvýšení o 2 %. Rovněž zaznamenali, že retenční časy byly stabilní, což jim umožnilo s větší jistotou identifikovat píky kanabinoidů ve vzorcích. Příklad je znázorněn na obrázku 4, na kterém jsou porovnány dvě různé matrice, hořká čokoláda a květ konopí. Oba vzorky obsahovaly měřitelné množství Δ9-THC a rozdíly v retenčním čase mezi oběma matricemi byly minimální.

Obrázek 4. Srovnání elučního vzorce mezi vzorky hořké čokolády a konopných květů (bez příměsi).

Závěr

Po vyhodnocení několika kolon HPLC společnost SupraRnD úspěšně vyvinula robustní a odolnou metodu s použitím kolony Ascentis^® Express C18 pro analýzu 17 kanabinoidů v různých matricích. Metoda byla dosud úspěšně použita na pět různých typů vzorků včetně květů, mastí, čokolády, koncentrátů a gumových bonbónů. Kolona Ascentis^® Express C18 byla pro konečnou metodu vybrána na základě stability retenčního času při opakovaném použití a schopnosti zachovat chromatografický výkon pro kanabinoidy. V současnosti používaná kolona navíc vykazuje minimální nárůst protitlaku v průběhu > 1500 vstřiků.

* Po zveřejnění těchto údajů společnost SupraRnD později odstranila krok zmrazení a homogenizovala celé květy při pokojové teplotě. To bylo provedeno proto, aby se snížila možnost nafouknutí obsahu vlhkosti kondenzací atmosférické vody na studených vzorcích.

Produkty

SLOUPCE HPLC

Loading

Certifikované referenční materiály

Loading

ROZPOUŠTĚDLA A ČINIDLA

Příslušenství

Loading