Faktory ovlivňující vazbu analytu na membránové filtry: Příručka pro validaci filtrů ve farmaceutické analytické kontrole kvality.
Shrnutí:
Následující stříkačkové filtry Millex® prokázaly nízkou vazbu analytu na API v lékových formách použitých v této studii.
Acetaminofen a kyselina acetylsalicylová vykazovaly silnou vazbu na filtry Millex® obsahující nylonovou membránu.
Filtrace vzorků v kompendiálních metodách
Filtrace vzorků nachází uplatnění v kompendiálních metodách, jako je například lékopis Spojených států (USP) a Evropský lékopis (Ph. Eur.). Jednou z takových aplikací je zkouška rozpouštění pevných lékových forem, při níž se filtrací z odebraného vzorku odstraní nerozpuštěné částice léčiva a pomocné látky. Pokud tyto částice zůstanou v roztoku vzorku, mají potenciál se dále rozpouštět a vést k nepřesným údajům. USP <1092> Postup rozpouštění: Vývoj a validace obsahuje oddíl o provádění kompatibility s filtrem. Uvádí se v ní:
"Výběr vhodného filtračního materiálu je důležitý a měl by být proveden a experimentálně zdůvodněn již na počátku vývoje postupu rozpouštění."1
V Ph. Eur. 2.9.3 Zkouška rozpouštění pevných lékových forem se v poznámce k postupu pro přístroje 1 a 2 uvádí:
"Zkušební vzorky se filtrují ihned po odběru, pokud se neprokáže, že filtrace není nutná. Použije se inertní filtr, který nezpůsobuje adsorpci účinné látky nebo neobsahuje extrahovatelné látky, které by mohly interferovat s analýzou."2
Monografie, které zahrnují HPLC analýzu, jako je například analýza používaná k měření koncentrace účinné farmaceutické látky (API) a kvantifikace organických nečistot nebo příbuzných látek, často zahrnují krok filtrace testovaného roztoku před nástřikem do přístroje. Tento krok filtrace zajišťuje odstranění nerozpuštěných částic, které mohou potenciálně ucpat nebo poškodit kolonu HPLC, což vede k problémům se systémem a nepřesným výsledkům.3
Filtrace vzorku hraje klíčovou roli v analytických postupech, které ji používají jako součást kroku přípravy vzorku. Filtrační zařízení použité v metodě by nemělo ohrozit přesnost a reprodukovatelnost údajů. Proto by měly být k vyhodnocení ztrát analytu způsobených adsorpcí na membránových filtrech použity validační studie filtrů.
Vazba analytu na membránové filtry
Různé membránové filtry mohou vázat analyt v různé míře v závislosti na typu membrány a analytu a také na koncentraci analytu.
Cílem této studie bylo poskytnout návod pro výběr filtrů při vývoji a validaci metody se zvláštním důrazem na vazbu analytu na stříkačkové filtry. V rámci této studie byly hodnoceny následující charakteristiky membrán a analytů:
- Výběr membrán
- Vliv fyzikálně-chemických vlastností analytu
- Vliv koncentrace analytu
- Velikost pórů membrány
- Podmínky zpracování a vliv na výtěžnost analytu
Experimentální metody
Část 1. Hodnocení adsorpce analytu prostřednictvím studie výtěžnosti API
Studie rozpouštění léčivých přípravků byly provedeny s použitím několika komerčně dostupných přípravků a metod uvedených v příslušných monografiích USP. Vzorky byly filtrovány pomocí různých stříkačkových filtrů a byly shromažďovány různé frakce filtrátu. Filtrát byl analyzován pomocí HPLC pro kvantifikaci účinné farmaceutické látky (API). Centrifugované vzorky byly použity jako kontrola pro 100% výtěžnost analytu pro výpočet vazby analytu na stříkačkové filtry. Tabulka 1 uvádí přípravky použité v této studii. Tabulka 2 uvádí použité metody rozpouštění a HPLC.
Podobné studie byly provedeny také na vzorku stejnorodosti směsi, který poskytl jeden z našich zákazníků. Vzorek byl rozpuštěn ve směsi rozpouštědel a přefiltrován přes různé stříkačkové filtry. Byla provedena HPLC analýza filtrátu a výtěžnost byla vypočtena pomocí stejným způsobem připraveného standardu.
Část 2. Objemová výtěžnost vzorku
Objemová výtěžnost vzorku z různých stříkačkových filtrů byla stanovena filtrací pevného objemu vzorku přes stříkačkový filtr a změřením objemu kapaliny zachycené ve zkumavce. To poskytlo informace o objemu zadrženém stříkačkovým filtrem a jeho vlivu na vazbu analytu.
Výsledky a diskuse
K variabilitě a nepřesnostem v analytických výsledcích může dojít v důsledku ztráty analytu během filtrace vzorku. Proto je důležité pochopit faktory, které přispívají ke ztrátám analytu, aby bylo možné zavést spolehlivé analytické metody a účinně zmírnit tento problém.
Fyzikálně-chemické vlastnosti analytů a membrán
Vazba analytů závisí především na fyzikálně-chemických vlastnostech membrány i analytu, protože vazba je výsledkem různých sekundárních interakcí mezi analytem a membránou. Mezi běžné sekundární interakce, které vedou k vazbě analytu, patří elektrostatické interakce, vodíková vazba a hydrofobní interakce. Obrázek 1 ukazuje vazbu různých analytů z vícesložkového přípravku na migrénu pomocí tří různých stříkačkových filtrů Millex® obsahujících hydrofilní PTFE, Durapore® PVDF nebo nylonové membrány. Účinné farmaceutické látky (API) přítomné v tomto přípravku měly různé fyzikálně-chemické vlastnosti. Tento přípravek obsahuje kyselé (kyselina acetylsalicylová), neutrální (kofein) a zásadité (paracetamol) API.
Obrázek 1.Záchyt A) paracetamolu (278 µg/ml), B) kyseliny acetylsalicylové (278 µg/ml) a C) kofeinu (72 µg/ml) z vícesložkového přípravku proti migréně pomocí různých membránových filtrů. Výtěžnost byla měřena po 1prvním, 2druhém, 3tém a 5tém ml filtrátu.
Jak je patrné z obrázku 1, paracetamol i kyselina acetylsalicylová se silně vážou na přípravek Millex®. filtry obsahující nylonovou membránu, ale ne na filtry Millex® obsahující hydrofilní PTFE nebo Durapore® PVDF membrány. Na druhou stranu kofein nevykazuje vazbu na žádnou ze tří membrán vybraných v této studii.
Membrány hydrofilního PTFE i Durapore® PVDF mají velmi málo funkčních skupin, které mohou interagovat s různými analyty, což vede k nízké vazbě analytu a následně k vysoké výtěžnosti. Nylonová membrána obsahuje funkční skupiny aminokyselin a karboxylových kyselin a amidové vazby, které mohou interagovat s kyselými nebo zásaditými analyty prostřednictvím elektrostatických interakcí a interakcí vodíkových vazeb, což vede k vysoké vazbě analytu a nízké výtěžnosti. Výtěžnost analytu u nylonových stříkačkových filtrů lze zlepšit prostým nasycením stříkačkového filtru vzorkem, čímž se nasytí vazebná místa na membráně. To je jasně vidět na obrázku 1 pro druhý, třetí nebo pátý 1 ml filtrátu.
Koncentrace analytu
Kvantitativní výtěžnost analytu lze získat po úplném nasycení filtru analytem. Když je membránový filtr nasycen, není pozorována žádná další vazba analytu, protože stříkačkové filtry mají omezený povrch a také omezený počet funkčních míst, která umožňují vazbu analytu. Tento bod nasycení závisí na koncentraci analytu. Obecně platí, že s klesající koncentrací analytu se zvyšuje objem potřebný k úplnému nasycení filtru.
Obrázek 2 zobrazuje vliv koncentrace analytu na vazbu analytu a následnou výtěžnost naproxenu z přípravku. Tři různé koncentrace naproxenu v rozmezí od 244 ppm do 2,4 ppm byly filtrovány přes hydrofilní PTFE Millex® stříkačkové filtry a filtrát byl analyzován pomocí HPLC. Jak je patrné z obrázku 2, pro vysokou koncentraci naproxenu (244 ppm) nebyla pozorována žádná vazba analytu, a to ani bez jakéhokoli nasycení filtru (bez vyřazeného objemu). Při nižších koncentracích bylo dosaženo mírně nižší výtěžnosti pro první 1 ml filtrátu v důsledku neúplného nasycení stříkačkového filtru, ale kvantitativní výtěžnost lze získat pro třetí nebo pátý ml filtrátu (což naznačuje nasycení filtru). Vzhledem k tomu, že hydrofilní PTFE membrána obecně vykazuje nízkou vazbu analytu, byl tento vliv koncentrace nepatrný, ale přesto může být významný, pokud byla specifikace výtěžnosti velmi úzká.
Tato studie byla provedena s 0,45 µm i 0,2 µm hydrofilními stříkačkovými PTFE filtry Millex®, přičemž byly získány velmi podobné výsledky (obrázek 2). Velikost pórů membrány neměla významný vliv na nasycení stříkačkových filtrů naproxenem. Tento vliv na koncentraci je závislý na membráně a analytu, a proto by měl být při validačních studiích filtrů pečlivě zvolen objem vyřazeného materiálu v závislosti na koncentraci analytu.
Obrázek 2.Vliv koncentrace naproxenu na výtěžnost analytu při použití A) 0,45 µm a B) 0,2 µm hydrofilních stříkačkových PTFE filtrů Millex.
Příprava vzorku a standardů
Podmínky zpracování standardu a vzorku mohou ovlivnit vazbu analytu a následnou výtěžnost analytu. Podle správné laboratorní praxe by měl vzorek a standard projít stejným zpracováním, aby se předešlo jakémukoli vlivu podmínek zpracování na výtěžnost analytu. Níže uvedený příklad ukazuje, co se může stát, když jsou rozdíly v přípravě experimentálních vzorků a standardů. Jedná se o analýzu výtěžnosti analytu ze směsných stejnorodých vzorků. Vzorek byl rozpuštěn ve směsi rozpouštědel a poté přefiltrován pomocí stříkačkového filtru Durapore® PVDF Millex®. Před odběrem vzorku pro HPLC analýzu bylo pět mililitrů objemu filtrátu vyřazeno. Standard byl zpracován za tří různých podmínek:
- Standard 1: Standard vytvořený podle protokolu zákazníka (nefiltrovaný).
- Standard 2: Standard vytvořený rozpuštěním čisté sloučeniny ve směsi rozpouštědel s následnou filtrací pomocí různých Millex® stříkačkové filtry s 5 ml filtrátu vyřazeného před HPLC (filtrovaného).
- Standard 3: Použití směsného uniformního vzorku rozpuštěného ve směsi rozpouštědel a odstředění před analýzou HPLC (odstředěný vzorek).
Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3. Při použití standardu 2 pro výpočet výtěžnosti bylo dosaženo konzistentní a kvantitativní výtěžnosti pro všechny testované injekční filtry. To se očekává, protože standard i vzorek procházejí stejnou metodou zpracování, čímž se snižuje jakýkoli vliv vazby analytu na výtěžnost.
Na druhé straně, pokud byl pro výpočet výtěžnosti zvolen standard 1 nebo 3, byl pozorován negativní dopad na výtěžnost vzorku v důsledku vazby analytu. Tento vliv byl výraznější u stříkačkových filtrů Millex® Durapore® PVDF ve srovnání s hydrofilním PTFE filtrem Millex® stříkačkového filtru. Při použití stříkačkového filtru Durapore® PVDF byla rovněž pozorována určitá variabilita mezi jednotlivými šaržemi.
Volumetrická výtěžnost vzorku
Ve většině případů nejsou farmaceutické testy kontroly kvality omezeny počtem vzorků a volumetrická výtěžnost vzorku nemusí mít velký vliv na dostupnost vzorku. Při výpočtu vazby analytu však hraje objemová výtěžnost vzorku důležitou roli, protože objem potřebný pro nasycení filtru musí zohlednit objemovou retenci stříkačkových filtrů.
Obrázek 3 ukazuje objem vzorku získaný při filtraci 2 ml vody přes různé 25mm a 33mm stříkačkové filtry. Ze všech testovaných filtrů umožnily filtry Millex® (průměr 33 mm) získat zpět maximální objem vzorku (~1,4 ml) při filtraci 2 ml vody, zatímco stříkačkový filtr na bázi polypropylenové membrány (průměr 25 mm) získal zpět pouze 0,6 ml objemu vzorku. Tento zadržený objem závisí na konstrukci filtru a není do značné míry ovlivněn velikostí pórů membrány. U ostatních tří testovaných membránových filtrů byl ve stříkačkovém filtru zadržen přibližně 1 ml vzorku.
Obrázek 3.Obnovení objemu po filtraci 2 ml vody přes různé stříkačkové filtry. Hydrofilní PTFE filtry Millex® mají velikost 33 mm, zatímco všechny ostatní stříkačkové filtry (od dodavatelů B, C, D a E) měly velikost 25 mm. Testované membrány zahrnují hydrofilní PTFE, regenerovanou celulózu (RC) a polypropylen (PP).
Závěry
- Validace filtrů je důležitou součástí různých farmaceutických analytických testů kvality a při validaci metody je třeba zohlednit různé parametry filtrů. Vzhledem k tomu, že při těchto testech kontroly kvality je vyžadována přesná kvantifikace analytu, je vazba analytu důležitým faktorem, který je třeba při validaci filtru zvážit.
- Fyzikálně-chemické vlastnosti membrány a analytu mají největší vliv na výtěžnost analytu. Nízká koncentrace analytu tento vliv ještě zhoršuje.
- Velikost pórů membrány má na výtěžnost analytu omezený vliv, ale výběr velikosti pórů je dán navazující analytickou technikou.
- Různé techniky zpracování vzorku a standardu ovlivňují výtěžnost analytu, a proto je vhodnější, aby standard prošel stejným procesem jako vzorek.
- Různé konstrukce stříkačkových filtrů vedly k rozdílům v objemové výtěžnosti. To může být kritické v případě malých objemů vzorku a nasycení filtru.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?