HPLC di piccole molecole

Analisi di piccole molecole

Si definisce piccola molecola un composto a basso peso molecolare (tipicamente inferiore a 900 dalton). Esempi comuni di piccole molecole sono amminoacidi, lipidi, zuccheri, acidi grassi, alcaloidi, ecc.  

Per la separazione di piccole molecole si può ricorrere a diversi metodi fra cui cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), cromatografia liquida (LC), gascromatografia (GC), cromatografia su strato sottile (TLC) ed elettroforesi capillare (CE). Inoltre, per la loro identificazione si può scegliere tra spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) o spettrometria di massa (MS). Negli ultimi anni, la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) si è affermata come tecnica fondamentale per l’identificazione di piccole molecole.

Per ottenere i migliori risultati possibili nell'analisi di piccole molecole mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), UHPLC o LC-MS è necessario identificare la fase stazionaria e le condizioni della fase mobile più adatte. Nella scelta della fase stazionaria, un elemento importante di cui tener conto sono le caratteristiche chimiche dell’analita. Altri fattori come la velocità del flusso, la matrice e il numero di componenti del campione concorrono a individuare il materiale più adatto per la fase stazionaria.

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HPLC di piccole molecole

L’analisi HPLC di piccole molecole molto spesso è condotta nella modalità di separazione detta "in fase inversa". Per separare composti polari, sono adatte anche la cromatografia a interazione idrofilica (HILIC) e la cromatografia in fase normale, anche se la HILIC è il metodo preferito. Per la separazione di composti ionici si può ricorrere a tecniche di scambio ionico e per gli anioni o i cationi inorganici si può utilizzare anche la cromatografia ionica.

Le colonne per HPLC possono essere impaccate con particelle di silice completamente porose o con particelle di silice porose solo in superficie o, ancora, con particelle polimeriche, oppure possono essere formate da una barra di silice monolitica che costituisce la fase stazionaria. Si usano anche particelle di allumina, zirconia e carbonio. Le dimensioni dei pori della fase stazionaria per la separazione di piccole molecole si situano tipicamente nell’intervallo fra 60 Å - 160 Å. In HPLC, le dimensioni delle particelle della fase stazionaria sono generalmente comprese tra 3 e 5 µm. In UHPLC si impiegano particelle più piccole, dell’ordine di 2 µm o anche meno. La fase stazionaria può essere soggetta a diverse modificazioni. Nella cromatografia a fase inversa (RP), una catena alchilica C18 è la funzionalizzazione più usata. Tuttavia, la disponibilità di altre modificazioni come C30, C8, fenil, pentafluorofenil, di una vasta gamma di funzionalizzazioni più polari, ma anche di modificazioni che conferiscono alla fase stazionaria proprietà chirali o la rendono adatta allo scambio ionico, consente di separare quasi tutti i composti solubili in liquidi. La fase mobile per la cromatografia RP-HPLC è tipicamente costituita da un tampone acquoso o da acqua e solventi organici miscibili con acqua, come acetonitrile o metanolo.

Preparazione dei campioni per HPLC

Campioni complessi e ricchi di matrice, come alimenti, bevande, cosmetici, campioni biologici e formulazioni farmaceutiche (es. creme, sciroppi) richiedono efficienti protocolli di preparazione del campione per eliminare i componenti indesiderati ed estrarre selettivamente l’analita di interesse. Questo è un fattore cruciale quando la fase stazionaria è costituita da particelle di dimensioni molto ridotte, come nel caso dell'UHPLC dove le particelle sono di 2 µm o anche più piccole. Metodi comuni per la preparazione dei campioni sono l’estrazione liquido-liquido, l’estrazione in fase solida (SPE) e, nel caso di campioni biologici, anche la precipitazione di proteine e la filtrazione. Lo scopo principale della preparazione del campione, oltre all’eluizione selettiva del composto di interesse e alla pre-concentrazione, è la protezione della fase stazionaria da ostruzioni causate dalla matrice del campione. Le colonne per HPLC in silice monolitica, tollerando meglio la matrice, richiedono una preparazione del campione meno rigorosa rispetto alle colonne costituite da particelle. 

Derivatizzazione

Alcune molecole devono essere derivatizzate prima (pre-colonna) o dopo (post-colonna) la separazione HPLC. La derivatizzazione converte gli analiti in derivati che assicurano una maggiore sensibilità o una migliore ritenzione cromatografica nell'analisi HPLC. Per la derivatizzazione, si impiegano reagenti chimici aventi le proprietà chimiche e fisiche opportune.

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