mRNA-Synthese für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika

• Wie mRNA-Impfstoffe Immunität induzieren
• Vorteile von mRNA als Impfstoffmodalität
• Aufbereitung von Plasmid-DNA (pDNA) für die mRNA-Synthese
• In-Vitro-Transkription und Capping von mRNA
• mRNA-Synthesereagenzien für die In-Vitro-Transkription (IVT)
• Aufreinigung und Analyse von mRNA
• Entfernung von dsRNA während der mRNA-Synthese
• Reagenzien für die Aufreinigung und Analyse von synthetischer mRNA

Das Potenzial der synthetischen mRNA, die Funktion von reifer mRNA zu rekapitulieren, hat ihre Einsatzmöglichkeit für eine Bandbreite von biopharmazeutischen Anwendungen erhöht. Bei diesen Therapienerfolgt eine In-vivo-Verabreichung von mRNA für den Ersatz von Proteinen, die Induktion von Stammzellen oder Krebsimmuntherapien. Zu den jüngsten wegweisenden pharmazeutischen Anwendungen gehören neuartige Ansätze für Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten, vor allem die mRNA-basierten Impfstoffe gegen SARS-CoV-2.

Eine umfassende Übersicht über unsere mRNA-Impfstoffprodukte und -lösungen finden Sie auf unserer Seite zu Impfstoffentwicklung und -herstellung.

SO INDUZIEREN mRNA-IMPFSTOFFE IMMUNITÄT

Impfstoffe auf Basis von Messenger-RNA (mRNA) gehen auf den Grundsatz zurück, dass mRNA Proteine codiert. Diese einfache Modalität für Impfstoffe löst eine immunologische Reaktion aus, indem sie das genetische Element, das das gesamte oder einen Teil eines Antigen-Proteins codiert, als translationsfähiges Molekül bereitstellt. mRNA, die das Zielantigen codiert, wird von Antigen-präsentierenden Zellen aufgenommen und in das pathogene Zielprotein translatiert, das wiederum eine Immunantwort auslöst. Dieser Ansatz ahmt den natürlichen Prozess nach, mit dem Viren Zellen infizieren.

VORTEILE VON mRNA ALS IMPFSTOFFMODALITÄT

Im Allgemeinen werden mRNA-Impfstoffe durch In-vitro-Synthese mittels eines enzymatischen Prozesses hergestellt. Die Entwicklung und Herstellung von mRNA-Impfstoffen ist im Vergleich zu traditionelleren Verfahren relativ einfach und kann in kurzer Zeit durchgeführt werden. Dadurch eignen sie sich für eine beschleunigte Entwicklung und Skalierung, was sich für aufkommende Szenarien im Bereich der öffentlichen Gesundheit schon jetzt als wichtig erwiesen hat. Innovationen im Design und in der Formulierung von mRNA-Impfstoffen, die die Thermostabilität verbessern, sodass die Impfstoffe nicht über eine Kühlkette vertrieben werden müssen, würden die Produktionskosten senken und die weltweite Verfügbarkeit verbessern. 

AUFBEREITUNG VON PLASMID-DNA (pDNA) für die mRNA-SYNTHESE

Für die Entwicklung von mRNA-basierten Impfstoffen wird in der Regel eine In-vitro-Transkription einer Plasmid-DNA-Matrize (pDNA) verwendet, um funktionelle synthetische mRNA herzustellen. Der Plasmidvektor enthält in der Regel die folgenden Elemente: einen vorgelagerten Promotor, der ausschließlich von der T7-, der SP6- oder der T3-RNA-Polymerase erkannt wird, die alle von Bakteriophagen abstammen; 5' UTR, cDNA, 3' UTR, einen nachgelagerten Poly-A-Schwanz sowie eine eindeutige Schnittstelle nach dem Poly-A-Schwanz.

Abbildung 1. Plasmiderzeugung für die In-vitro-Transkription (IVT). Nach der Gensynthese erfolgt die Klonierung der Ziel-DNA mithilfe eines Plasmidvektors (pDNA). Die pDNA wird in einer Bakterienkultur expandiert und dann mit Nukleinsäure-Aufreinigungsmethoden wie z. B. Membranen auf Siliziumdioxidbasis in Spin-Säulen gereinigt.

IN-VITRO-TRANSKRIPTION UND CAPPING VON mRNA

Bakteriophagen-RNA-Polymerase wird normalerweise zur Transkription linearisierter Plasmid-DNA verwendet. Die pDNA wird zunächst mit dem ausgewählten Enzym für die einzigartige Restriktionsstelle linearisiert. Nach der Aufnahme kann die linearisierte pDNA mit Methoden wie dem Phenol-Chloroform-Protokoll oder dem GenElute PCR Clean-Up Kit gereinigt werden. Für die Aufreinigung in großem Maßstab ist die Tangentialflussfiltration (TFF) oft ratsam, da sie leicht skaliert werden kann. Nach der Linearisierung erfolgt die In-vitro-Transkription und das Capping in einer gemischten Lösung aus rekombinanter RNA-Polymerase (T7, T3 oder SP6) und Nukleosidtriphosphaten sowie einem Cap-Analogon wie CleanCap^® Reagenz oder ARCA (Anti-Reverse Cap Analog). Das modifizierte Nukleosid wie N1-Methylpseudouridin-5'-Triphosphat (N1-Methylpseudo-UTP, 1-Methylpseudo-UTP) kann anstelle von GTP verwendet werden, um die angeborene Immunantwort zu unterdrücken, und wird in den aktuellen mRNA-Impfstoffen eingesetzt.  Die Effizienz des Capping von mRNA mit ARCA liegt im Durchschnitt bei 70 – 80 %, da es mit GTP konkurriert, während die Ausbeute an mRNA im Vergleich zur Standard-mRNA-Synthese um etwa ein Viertel reduziert ist.  Im Vergleich dazu hat sich gezeigt, dass das CleanCap^® Reagenz mit einer Capping-Effizienz von 94 % arbeitet, ohne die Ausbeute der mRNA-Produktion zu beeinträchtigen. Alternativ kann das Capping auch erreicht werden, indem die Transkription ohne ein Cap-Analogon durchgeführt wird und stattdessen der vom Vaccinia-Virus codierte Capping-Komplex (Capping-Enzym, 2'-O-Methyltransferase, GTP und S-Adenosylmethionin (SAM)) verwendet wird. Die Effizienz des Capping hängt von der Sekundärstruktur der betreffenden mRNA ab. Wenn die Länge des Poly-A-Schwanzes der pDNA-Matrize nicht ausreicht (bis zu 150 Basen), kann er mithilfe des Poly-A-Enzyms verlängert werden.

Abbildung 2. Die mRNA-Synthese wird durch die Linearisierung der pDNA, die In-vitro-Transkription (IVT) der mRNA mit zellfreien Methoden und das Capping der mRNA mit einem Cap-Analogon oder einem von einem Virus kodierten Capping-Komplex abgeschlossen.

AUFREINIGUNG UND ANALYSE VON mRNA

Der erste Schritt bei der mRNA-Aufreinigung besteht darin, die linearisierte pDNA-Matrize mithilfe von Desoxyribonuklease oder DNase zu entfernen. Die mRNA wird anschließend mit Lithiumchlorid (LiCl) ausgefällt und mit 75%igem Ethanol gewaschen. Das resultierende mRNA-Pellet kann mit Wasser oder Resuspensionspuffer resuspendiert werden. Diese Fällungsmethode sollte jedoch bei der Skalierung vermieden werden, zum einen, weil sie relativ schwierig zu skalieren ist, zum anderen, weil die Verwendung von gefährlichen Lösungsmitteln bei der GMP-Produktion vermieden werden sollte. Das GenElute™ mRNA Miniprep Kit wird für die Aufreinigung im kleineren Maßstab empfohlen. In größerem Maßstab kann die Tangentialflussfiltration (TFF) unter Verwendung von Pellicon^®-Kassetten durchgeführt und linear skaliert werden.

ENTFERNUNG VON dsRNA WÄHREND DER mRNA-SYNTHESE

Doppelstrangige RNA oder dsRNA, ein Transkriptionsnebenprodukt, ist eine wesentliche Begleiterscheinung der mRNA-Synthese. Die dsRNA kann angeborene Immunantworten stimulieren, die die Translation der gelieferten mRNA reduzieren. Bei der Synthese von mRNA für die Entwicklung von Impfstoffen sollte die dsRNA daher entfernt werden. Die Reinigung auf Zellulosebasis mit Zellulosefasern kann für die Entfernung von dsRNA in verschiedenen Maßstäben eingesetzt werden.