qPCR-Reagenzien und -Kits von Kapa Biosystems

Quantitative Echtzeit-PCR-Kits und Reagenzien

Quantitative PCR (qPCR) und qRT-PCR-Reaktionen erfordern Reagenzien, die genau und zuverlässig sind. Die qPCR- und qRT-PCR-Reagenzien und -Kits von Kapa Biosystems sind so konzipiert, dass sie selbst bei den schwierigsten Templates und Ausgangsstoffen konsistente Ergebnisse liefern. Entdecken Sie unsere Kapa Biosystems qPCR-Reagenzien und erfahren Sie, wie Sie die Effizienz Ihres qPCR-Workflows verbessern und Ihre nächste bahnbrechende Entdeckung quantifizieren können.

• KAPA PROBE FAST
• KAPA PROBE FORCE
• KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kits für die qRT-PCR
• KAPA HRM FAST

KAPA PROBE FAST

Präzise, reproduzierbare und vielseitige Kits für alle sondenbasierten qPCR-Anwendungen.

qPCR-Kits für KAPA PROBE FAST liefern schnelle und reproduzierbare Ergebnisse für alle sondenbasierten qPCR-Anwendungen. Diese Kits enthalten ein gebrauchsfertiges Mastermix für hochempfindliche und genaue Echtzeit-PCR unter Verwendung sequenzspezifischer fluorogener Sondenchemien, einschließlich Hydrolysesonden (z. B. TaqMan^®), FRET-Sonden und Verdrängungssonden (z. B. Molecular Beacons).

• Kompatibilität mit sondenbasierten qPCR-Anwendungen und -Instrumenten
• Diskrete Cluster in SNP-Genotypisierungs-Assays
• Breiter Dynamikbereich
• Hochstabiler Mastermix für Workflows mit hohem Durchsatz

Erzielen hervorragender Reproduzierbarkeit und Effizienz

• Schnelle, hochleistungsfähige 5-Farben-Multiplex-PCR
• Vergleichbare Abundanzwerte bei niedriger Kopienzahl
• Breiter Dynamikbereich von bis zu 10 Größenordnungen

Abbildung 1. Die Ergebnisse für alle 5 Amplikons in einer fünfstufigen Verdünnungsreihe wurden bei einem Penta-Plex-Test unter Verwendung eines Schnell-Zyklusprotokolls erzielt. Die Reaktionsvolumen enthielten auch humane genomische DNA (0,39 - 100 ng), 200 nM jedes Primers und 200 nM jeder Hydrolysesonde (ACTB - FAM^™/BHQ^®-1, ERBB2 - CAL Fluor^® Gold 540/ BHQ-1, ERBB3 - CAL Fluor Orange 560/ BHQ-2, EGFR - CAL Fluor Red 610/ BHQ-2, ACTG1 - Quasar^® 705/ BHQ-2) unter Verwendung des folgenden Schnellzyklusprotokolls: 95 ºC für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ºC, 15 s; bei 60 ºC, 15 s.

Genaue Differenzierung zwischen Allelen

• Außergewöhnliche Unterscheidung zwischen heterozygoten und homozygoten Allelen
• Diskrete Cluster in SNP-Genotypisierungs-Assays

Abbildung 2. Insgesamt 168 humane genomische DNA-Proben wurden zusammen mit 24 Negativkontrollen unter Verwendung eines ATP1B3 SNP-Genotypisierungs-Assays auf dem ABI 7900HT Echtzeit-PCR-System erfolgreich genotypisiert. Die Reaktionsvolumen umfassten auch humane genomische DNA (10 ng), 200 nM jedes Primers und 200 nM jeder Hydrolysesonde (Allel X - FAM/ BHQ^®-1, Allel Y - VIC/ BHQ-1) unter Verwendung des folgenden Standard-Zyklusprotokolls: 95 ºC für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ºC, 15 s; 60 ºC, 60 s.

Erhöhung der Flexibilität

• Kompatibel mit Standard- und Schnellzyklusprotokollen
• Genaue Quantifizierung beibehalten

Abbildung 3. Die Amplifikationskurven wurden entweder mit einem Standard-Zyklusprotokoll (95 ºC für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ºC, 15 s; 60 ºC, 60 s) oder mit einem Schnellzyklusprotokoll erstellt: 95 ºC für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ºC, 3 s; 60 ºC, 20 s. Die Reaktionsvolumen umfassten auch humane genomische DNA (10-fache Verdünnungen über einen Bereich von 0,1 ng bis 100 ng pro Reaktion), 200 nM jedes Primers und 200 nM der Hydrolysesonde hApoB100 (FAM/BHQ-1).

KAPA PROBE FORCE

Die KAPA PROBE FORCE ist unser Inhibitor-resistentester qPCR-Mastermix, durch den eine DNA-Aufreinigung vermieden und somit ein optimierter Proben-zu-Cq-Workflow möglich wird. Der Mastermix enthält eine DNA-Polymerase der dritten Generation, die entwickelt wurde, um PCR-Inhibitoren in Blut, Gewebe und Pflanzen zu überwinden. Analysieren Sie Rohproben, die eine vergleichbare Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit aufweisen wie Proben, die aus aufgereinigter DNA stammen.

• Die KAPA PROBE FORCE bietet:
• Direkte qPCR aus Rohblut, Gewebe- und Pflanzenextrakten
• Proben-zu-Cq-Workflows in < 1 Stunde
• Hohe Effizienz für genaue, reproduzierbare und empfindliche Ergebnisse
• Hervorragende Toleranz gegenüber Übertragungsinhibitoren
• Multiplex-Kompatibilität mit Rohextrakten

Rationalisierung der Proben-zu-Cq-Workflows

Die KAPA PROBE FORCE ermöglicht den Einsatz von schnellen Methoden zur Extraktion von Roh-DNA und überwindet verschleppte Inhibitoren. Konkurrierende Mastermixe, die in herkömmlichen qPCR-Workflows für Blut, Gewebe und Pflanzen verwendet werden, erfordern eine robuste vorgelagerte Probenverarbeitung (z. B. Säulenaufreinigung oder Nuklease-Verdau).

• Eliminierung des Zeit- und Kostenaufwands für die Probenaufreinigung durch direkte Amplifikation aus Rohproben
• Analyse eines breiten Spektrums von Probentypen, einschließlich Vollblut, Zellen, Mäuseschwänzen, FFPE, Blättern, Stängeln, Samen und Erde

Sehr präzise und reproduzierbare Ergebnisse

• Die Kits enthalten eine DNA-Polymerase der dritten Generation, die für robuste(n) Zielamplifikation und -nachweis entwickelt wurde
• Das Enzym behält seine hohe Reaktionseffizienz in Gegenwart von PCR-Inhibitoren bei und ermöglicht so eine zuverlässige Datengenerierung

Abbildung 5. Hocheffiziente Zielamplifikation. Die Reaktionseffizienz von mit Inhibitoren dotierten Proben wurde untersucht und mit der von aufgereinigter DNA verglichen. Bei den verschiedenen Inhibitortypen lagen die Wirkungsgrade zwischen 90 und 110 %.

Durchbruch zu hohen qPCR-Inhibitor-Konzentrationen

Die KAPA PROBE FORCE zeigt eine konsistente und robuste Amplifikation ohne beobachtbare Cq-Verzögerungen über alle getesteten Inhibitoren hinweg.

• Höhere Empfindlichkeit für gehemmte Blut-, Gewebe- und Pflanzenproben
• Umwandlung aufgereinigter DNA-Assays in Workflows mit Rohmaterialien ohne Verlust an Datenqualität

Abbildung 6. Breites Spektrum hoher Inhibitorresistenz. Die Basislinienleistung der KAPA PROBE FORCE und konkurrierender Mastermischungen wurde durch die Erstellung von Standardkurven mit aufgereinigter DNA gemäß den vom jeweiligen Hersteller empfohlenen Zyklusbedingungen gemessen. Es wurden Serienverdünnungen in den folgenden Bereichen durchgeführt: Human: 100 ng – 10 pg; Maus: 100 ng – 10 pg; Pflanzen: 25 ng – 8 pg; und Bakterien: 2 ng – 2 fg. Die Inhibitoren wurden einzeln in hohen Konzentrationen in die aufgereinigten DNA-Proben dotiert, um ihre Auswirkungen auf die Cq-Werte zu bestimmen.

Effizientes Multiplexen von Rohproben

• Beschleunigung der Genotypisierungsanalyse mit allelischer Diskriminierung in einer Einzelreaktion roher DNA-Extrakte
• Maximierung der Datenerfassung aus wertvollen Proben, Erhöhung des Durchsatzes und Senkung der Kosten

Abbildung 7. Cru5e-Proben Duplex-SNP-Nachweis. Die KAPA PROBE FORCE ermöglicht eine genaue Genotypisierung und ein enges Clustering in Gegenwart von Rohextrakten (A) Baumwollsamen, 0,5M NaOH-Extraktion; (B) Weinrebenblättern, 75 mM Tris-HCl und 5 mM TCEP-Extraktion; (C) Mausblut, FTA 0,5 mm Scheibe; und (D) Extrakt aus Mauseschwänzen, NaOH-Extraktion, für eine schnelle SNP-Analyse.

Abbildung 8. Hocheffiziente 4-Plex-Leistung. Vier Targets wurden in einem Multiplex-Assay mit der KAPA PROBE FORCE und drei kompetitiven Mastermischungen amplifiziert. 100 pg gDNA der Maus wurden für folgende Genziele amplifiziert: (A) Isg20 (FAM/BHQ-1), (B) F13a1 (CAL Fluor Orange 560), (C) Camta1 (Quasar 670) und (D) Ube20 (Quasar 705). Es wurden 500 nM-Primer und 110 nM-Sonden unter den folgenden Zyklusbedingungen eingesetzt: 95 °C für 30 s, gefolgt von 50 Zyklen bei 95 °C für 3 s und 60 °C für 30 s.

KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kits für die qRT-PCR

Die KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kits für die qRT-PCR sind für optimale Leistung unter strengen qRT-PCR-Reaktionsbedingungen konzipiert und weisen drastische Verbesserungen in Bezug auf Sensitivität, Spezifität, Reaktionseffizienz und Fluoreszenz auf. Das Kit ist für die schnelle RNA-Quantifizierung in einem Schritt und mit einem Röhrchen optimiert und reduziert experimentelle Schwankungen und Kontaminationen mit einem praktischen qRT-PCR-Protokoll. Die Kits enthalten M-MuLV reverse Transkriptase, RNase-Inhibitor und eine neuartige, durch gerichtete Evolution erzeugte DNA-Polymerase.

Die KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kits für die qRT-PCR sind für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet und umfassen:

• SNP-Genotypisierung
• Analyse der Genexpression
• Microarray-Validierungen
• Gen-Knockdown-Validierungen
• RNAi und miRNA-Forschung

Erhöhung der Signal- und Reaktionseffizienz

• Gleichbleibend höhere Amplifikationseffizienzen für präzise qPCR
• Höhere Fluoreszenz, frühere Cq-Werte und verbesserte Reaktionseffizienzen

Abbildung 9. RRMI-Gen (94 bp, 45,7 % GC), amplifiziert aus einer 10-fachen RNA-Verdünnungsreihe (100 ng bis 10 pg pro 20 μl-Reaktion), die aus menschlicher Plazenta isoliert wurde. Das KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kit für die qRT-PCR weist frühere Cq-Werte, höhere Fluoreszenz und optimale Reaktionseffizienzen auf.

Amplifikation über ein breites Spektrum von Ziellängen

• Robuste Leistung unabhängig von der Amplikongröße

MS2-Bakteriophagen-RNA-Ziele mit zunehmender Länge wurden mit 0,8 pg pro 20 μl-Reaktion amplifiziert. Das KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kit für die qRT-PCR bietet eine hohe Leistung für alle Amplikonlängen.

Verbesserung der Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit

• Präzise Abfrage über einen weiten Bereich von RNA-Template-Konzentrationen

Abbildung 11. 279 bp-Fragment, amplifiziert in 6 Replikaten aus einer 10-fachen Verdünnungsreihe kommerzieller MS2-Bakteriophagen-RNA (80 pg bis 0,8 fg pro 20 μl-Reaktion). Für alle 6 Replikate pro Datensatz wurde eine Reaktionseffizienz von 95 % berechnet.

Weitere Informationen finden Sie in den FAQ zu den KAPA SYBR^® FAST One-Step-Kits für die qRT-PCR.

KAPA HRM FAST

Akkurater Nachweis von DNA-Sequenzvariationen

Die hochauflösende Schmelzanalyse (High Resolution Melt, HRM) ist eine Technik zur schnellen Post-PCR-Analyse von genetischen Mutationen oder Varianz in Nukleinsäuresequenzen mit hohem Durchsatz. Der KAPA HRM FAST-Master Mix enthält ein neuartiges DNA-Polymerase- und Puffersystem sowie den Sättigungsfarbstoff EvaGreen®, der für eine maximale Unterscheidung zwischen Sequenzvarianten optimiert ist.

KAPA HRM FAST-Kits bieten:

• SNP-Genotypisierung
• Entdeckung von Mutationen (Genscanning)
• Screening auf Heterozygotie
• Erstellen des DNA-Fingerabdrucks
• DNA-Methylierungsanalyse

Genauer Nachweis von Typ IV SNP

• 95 % Nachweisrate, auch wenn Mitbewerber erfolglos bleiben*
• Verkürzte Reaktionszeiten

Abbildung 12. *A) Der Typ IV SNP rs641805 befindet sich auf einem Intron des Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD)-Gens. Die Reaktionen enthielten außerdem 2,5 mM MgCl2, 0,2 μM jedes Primers und 10 ng humane genomische DNA. PCR und HRM wurden mit einem schnellen, zweistufigen Zyklusprotokoll (40 Zyklen) mit 5 s Denaturierung (95 °C) und 20 s Hybridisierung/Elongation (60 °C) durchgeführt.
*B) Der Typ IV SNP rs641805 befindet sich auf einem Intron des Dihydropyrimidin-Dehydrogenase (DPD)-Gens. Die Reaktionen enthielten außerdem 2,5 mM MgCl2, 0,2 μM jedes Primers und 10 ng humane genomische DNA. PCR und HRM wurden mit einem schnellen, zweistufigen Zyklusprotokoll (40 Zyklen) mit 5 s Denaturierung (95 °C) und 20 s Hybridisierung/Elongation (60 °C) durchgeführt. Der ABI MeltDoctor HRM-Mastermix wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den gleichen Template-DNA-Proben verwendet.

Maximierung der Unterschiede in den Sequenzvarianten

• Entwickelt, um die Unterschiede im Schmelzverhalten zu maximieren
• Erhöhte Empfindlichkeit

Maximierung der Unterschiede in den Sequenzvarianten

• Entwickelt, um die Unterschiede im Schmelzverhalten zu maximieren
• Erhöhte Empfindlichkeit

Schneller Wechsel von Zelle zu SNP

• Ermöglicht Extraktion, Amplifikation und HRM in weniger als 2 Stunden bei Verwendung in Kombination mit dem KAPA Express Extract-Kit

Abbildung 14. DNA-Extrakte wurden aus Wangenabstrichen von 36 Personen mit Hilfe von KAPA Express Extract DNA-Extraktionskits (gemäß den empfohlenen Protokollen) hergestellt. Die DNA-Extrakte wurden direkt in Reaktionen verwendet, die ebenfalls 2,5 mM MgCl2 und 0,2 μM der einzelnen Primer enthielten. PCR und HRM wurden mit einem schnellen, zweistufigen Zyklusprotokoll (45 Zyklen) mit 5 s Denaturierung (95 °C) und 30 s Hybridisierung/Elongation (60 °C) durchgeführt.