C9891

Collagénase from Clostridium histolyticum

Type IA, 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid, ≥125 CDU/mg solid, For general use

• Synonyme(s) : Clostridiopeptidase A
• Numéro CAS: 9001-12-1
• Numéro de classification (Commission des enzymes): 3.4.24.3 (BRENDA, IUBMB)
• Numéro CE : 232-582-9
• Numéro MDL: MFCD00130830
• Code UNSPSC : 12352204
• Nomenclature NACRES : NA.54

Propriétés

• Niveau de qualité: 200
• Forme: essentially salt-free, lyophilized powder
• Activité spécifique: ≥125 CDU/mg solid; 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid
• Poids mol.: 68-130 kDa
• Technique(s): cell culture | mammalian: suitable; single cell analysis: suitable
• Solubilité: TESCA buffer (50 mM TES, 0.36 mM Calcium chloride, pH 7.4): soluble
• Application(s): diagnostic assay manufacturing
• Conditions d'expédition: wet ice
• Température de stockage: −20°C

Description

Application

L'enzyme a également servi, en association avec d'autres protéases, à la désagrégation de tissus de tumeur humaine, de rein de souris, de cerveau humain et d'épithélium de poumon. Elle est aussi utile dans les études de perfusion de foie et de rein, de digestion de pancréas et d'isolement de cellules de rein non parenchymateux et d'hépatocytes de rat. L'enzyme proposée par Sigma a été utilisée pour la digestion de collagène de type I provenant d'os spongieux et corticaux de bovin.[1] Elle a également été utilisée comme contrôle positif dans un test de FALGPA sur des cellules de streptocoques du Groupe B[2].

Ce produit peut être utilisé pour préparer des suspensions de cellules individuelles en vue d'un séquençage.

Actions biochimiques/physiologiques

La collagénase est activée à l′aide de quatre atome-grammes de calcium par mole d′enzyme. Elle est inhibée par l′acide éthylèneglycol-bis(bêta-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique, le bêta-mercaptoéthanol, le glutathion, l′acide thioglycolique et la 8-hydroxyquinoline.

La libération efficace de cellules à partir d′un tissu nécessite l′action de collagénases et de la protéase neutre. La collagénase est activée à l′aide de quatre grammes d′atomes de calcium (Ca²⁺) par mole d′enzyme. On pense que le filtrat de culture contient au moins 7 protéases différentes, de poids moléculaires allant de 68 à 130 kDa. Le pH optimal se situe entre 6,3 et 8,8. L′enzyme est typiquement utilisée pour digérer les constituants conjonctifs d′échantillons tissulaires afin de libérer des cellules individuelles. Le traitement par une collagénase peut provoquer la mort de certaines cellules. La digestion nécessite généralement des concentrations de 0,1 à 5 mg/ml. La durée de réaction varie de 15 minutes à plusieurs heures pour dissocier efficacement les cellules sans trop provoquer de mort cellulaire. Utiliser de préférence un tampon de Krebs Ringer additionné de calcium et d′ASB, et du Zn²⁺ pour l′activité. L′enzyme reconnaît la séquence -R-Pro-8-X-Gly-Pro-R-, où X est la plupart du temps un acide aminé neutre. L′activité enzymatique est inhibée par les substances suivantes : acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N′,N′-tétraacétique (EGTA)4 ; β-mercaptoéthanol ; glutathion (réduit) ; acide thioglycolique, sodium ; 2,2′-dipyridyle ; 8-hydroxyquinoline, cystéine.

Attention

Tel qu′il est livré, le produit est stable un an à -20 °C. Aucune perte de l′activité FALGPA ou protéase n′est observée au bout de 30 jours à 37 °C, 50 °C et -20 °C. Les solutions de collagénase brute sont stables lorsqu′elles sont congelées rapidement en aliquotes (à 10 mg/ml) et conservées à -20 °C. Tout cycle de congélation/décongélation supplémentaire détériore la solution. Le produit conserve 100 % de son activité pendant 7 heures lorsqu′il est placé sur de la glace.

Définition de l'unité

Une unité de digestion de collagène (UDC) libère une quantité de peptides à partir du collagène d′un tendon d′Achille de bovin équivalant, en termes de couleur avec la méthode à la ninhydrine, à 1,0 μmole de leucine en 5 heures à pH 7,4 et à 37 °C en présence d′ions calcium. Une unité d′hydrolyse de FALGPA hydrolyse 1,0 μmole de furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala par minute à 25 °C. Une unité de protéase neutre hydrolyse la caséine et produit une couleur équivalente à 1,0 μmole de tyrosine en 5 heures à pH 7,5 et à 37 °C. Une unité de clostripaïne hydrolyse 1,0 μmole de BAEE par minute à pH 7,6 et à 25 °C en présence de DTT.

Notes préparatoires

Ce produit est équivalent à la première fraction de sulfate d′ammonium (jusqu′à 40 %) selon Mandl, I., et coll., J. Clin. Invest., 32, 1323 (1953). Les solutions sont habituellement préparées à une concentration de 1-2 mg/ml dans du tampon TESCA (TES 50 mM, chlorure de calcium 0,36 mM, pH 7,4 à 37 °C).

Informations sur la sécurité

• Pictogrammes: GHS08,GHS07
• Mention d'avertissement: Danger
• Mentions de danger: H315,H319,H334,H335
• Conseils de prudence: P261 - P264 - P271 - P280 - P302 + P352 - P305 + P351 + P338
• Classification des risques: Eye Irrit. 2 - Resp. Sens. 1 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
• Organes cibles: Respiratory system
• Code de la classe de stockage: 11 - Combustible Solids
• Classe de danger pour l'eau (WGK): WGK 1
• Point d'éclair (°F): Not applicable
• Point d'éclair (°C): Not applicable
• Équipement de protection individuelle: dust mask type N95 (US), Eyeshields, Faceshields, Gloves