Ensaios de atividade enzimática

Figura 1. Representação do processo de ensaio de atividade enzimática, começando com um doador de fluorescência e um aceitador de extinção em um substrato que passa por clivagem enzimática para remover o supressor, mostrando um aumento na atividade fluorescente que sinaliza a ocorrência de atividade enzimática.

Os ensaios de atividade enzimática são predominantemente realizados pelos pesquisadores para identificar a presença ou a quantidade de uma enzima específica em um organismo, tecido ou amostra. Exemplos dessas enzimas incluem α-amilase, catalase, lacase, peroxidase, lisozima e as enzimas repórteres fosfatase alcalina e luciferase. Diversos reagentes e metodologias estão amplamente disponíveis e permitem a investigação de interações específicas entre enzima e substrato. A escolha de uma solução adequada de fluxo de trabalho depende da sensibilidade de que o pesquisador necessita. Soluções colorimétricas são úteis para detecção, enquanto os reagentes à base de fluorescência são mais adequados para a quantificação da atividade enzimática.

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Determinando as condições ideais para atividade enzimática

Embora vários ensaios enzimáticos tenham sido descritos na literatura, é necessário modificar esses procedimentos para os requisitos exclusivos da enzima em investigação. A atividade específica de uma enzima depende de inúmeros fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e concentração de todos os componentes no ensaio. Para condições como pH, a atividade enzimática frequentemente se assemelha a uma curva de distribuição normal. A maior atividade em um pH específico é relatada como a V_máx, com atividade decrescente observada em ambas as extremidades da curva. Algumas enzimas podem requerer considerações adicionais para compostos que não estão diretamente envolvidos com a reação, como íons metálicos, detergentes e moléculas hidrofóbicas.

Determinando as condições ideais para atividade enzimática

Embora vários ensaios enzimáticos tenham sido descritos na literatura, é necessário modificar esses procedimentos para os requisitos exclusivos da enzima em investigação. A atividade específica de uma enzima depende de inúmeros fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e concentração de todos os componentes no ensaio. Para condições como pH, a atividade enzimática frequentemente se assemelha a uma curva de distribuição normal. A maior atividade em um pH específico é relatada como a V_máx, com atividade decrescente observada em ambas as extremidades da curva. Algumas enzimas podem requerer considerações adicionais para compostos que não estão diretamente envolvidos com a reação, como íons metálicos, detergentes e moléculas hidrofóbicas.

Componentes de ensaios enzimáticos

Para muitas enzimas, a água é o solvente padrão, pois corresponde ao mesmo ambiente aquoso encontrado nas células. No entanto, solventes orgânicos são usados em alguns casos em que enzimas ou componentes enzimáticos são insolúveis em água. Além disso, substratos e cofatores, catalisadores de reações enzimáticas, também são componentes críticos em um ensaio de atividade enzimática. Os substratos e cofatores são frequentemente identificados com base em suas funções em condições fisiológicas. Assim, os substratos e cofatores interagem amplamente e podem ser necessários para diversas enzimas. Os tampões e íons são elementos críticos adicionais a serem considerados, pois são essenciais para estabilizar o pH ao longo do ensaio e influenciam diretamente a atividade enzimática. Por exemplo, íons metálicos mono ou bivalentes podem ser necessários para a atividade catalítica dos cofatores na reação e são essenciais para a atividade enzimática.

Realização de um ensaio enzimático

O preparo dos componentes do ensaio enzimático é uma primeira etapa prática. Em geral, é vantajoso preparar um grande volume de mistura de ensaio, excluindo um componente ativador, para evitar erros de pipetagem, que são inevitáveis quando se pipeta volumes pequenos. Uma vez que a mistura de ensaio é preparada, os pesquisadores adicionam o componente de ativação final à mistura para iniciar o ensaio de atividade. O pré-tratamento da enzima armazenando-a em baixas temperaturas e, muitas vezes, incluindo vários aditivos químicos ou proteicos, são fatores críticos para garantir a estabilidade enzimática e maximizar a atividade antes do início do ensaio. Após os materiais de reação serem combinados em um recipiente de observação, todos os componentes devem ser misturados com rapidez e rigor à medida que a reação inicia. O registro de dados deve começar imediatamente após a mistura, e o sinal detectável do ensaio deve ser plotado durante todo o tempo da reação.

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