17-10404
Biossensor lentiviral LentiBrite RFP-p62
Sinônimo(s):
Sequestosome-1, Sequestosome, Ubiquitin-binding protein p62, EBI3-associated protein, p62
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About This Item
Código UNSPSC:
12352207
eCl@ss:
34360190
NACRES:
NA.32
Produtos recomendados
fabricante/nome comercial
Chemicon®
LentiBrite
Nível de qualidade
técnica(s)
cell based assay: suitable
immunocytochemistry: suitable
immunofluorescence: suitable
transfection: suitable
nº de adesão UniProt
método de detecção
fluorometric
Condições de expedição
dry ice
Informações sobre genes
human ... SQSTM1(8878)
Categorias relacionadas
Descrição geral
Leia a nossa nota de aplicação em Nature Methods!
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
(Clique Aqui!)
Saiba mais sobre as vantagens dos nossos biossensores lentivirais LentiBrite! Clique aqui
Os biossensores podem ser usados para detectar a presença/ausência de uma determinada proteína, bem como a localização subcelular dessa proteína em uma célula viva. As caudas fluorescentes são frequentemente desejadas como um meio para visualizar a proteína de interesse dentro de uma célula por microscopia fluorescente ou captura em vídeo com lapso de tempo. Visualizar células vivas sem interferências permite que os pesquisadores observem as condições celulares em tempo real.
Os sistemas de vetores lentivirais são uma ferramenta de pesquisa popular usada para introduzir produtos gênicos nas células. A transfecção lentiviral tem vantagens em relação aos métodos não virais, como transfecção à base de compostos químicos, incluindo a transfecção de maior eficiência de células em divisão e não se dividindo, a expressão estável em longo prazo do transgene e a baixa imunogenicidade.
A EMD Millipore apresenta os biossensores lentivirais LentiBrite, um novo conjunto de partículas lentivirais pré-embaladas que codificam proteínas importantes e fundamentais envolvidas na autofagia, apoptose e estrutura celular para visualização sob diferentes células/estados de doença em análise de células vivas e in vitro.
LentiBrite da EMD Millipore As partículas lentivirais RFP-p62 proporcionam fluorescência brilhante e localização precisa para permitir a análise da autofagia de células vivas em tipos celulares de difícil transfecção.
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
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Os biossensores podem ser usados para detectar a presença/ausência de uma determinada proteína, bem como a localização subcelular dessa proteína em uma célula viva. As caudas fluorescentes são frequentemente desejadas como um meio para visualizar a proteína de interesse dentro de uma célula por microscopia fluorescente ou captura em vídeo com lapso de tempo. Visualizar células vivas sem interferências permite que os pesquisadores observem as condições celulares em tempo real.
Os sistemas de vetores lentivirais são uma ferramenta de pesquisa popular usada para introduzir produtos gênicos nas células. A transfecção lentiviral tem vantagens em relação aos métodos não virais, como transfecção à base de compostos químicos, incluindo a transfecção de maior eficiência de células em divisão e não se dividindo, a expressão estável em longo prazo do transgene e a baixa imunogenicidade.
A EMD Millipore apresenta os biossensores lentivirais LentiBrite, um novo conjunto de partículas lentivirais pré-embaladas que codificam proteínas importantes e fundamentais envolvidas na autofagia, apoptose e estrutura celular para visualização sob diferentes células/estados de doença em análise de células vivas e in vitro.
- Pré-embaladas, fluorescentemente marcadas com GFP e RFP
- Transfecção de maior eficiência em comparação com os métodos tradicionais de transfecção à base de compostos químicos e outros métodos de transfecção não viral
- Capacidade de transfectar tipos de células em divisão, não se dividindo e de difícil transfecção, como células primárias ou células-tronco
- Não interferem na função celular
LentiBrite da EMD Millipore As partículas lentivirais RFP-p62 proporcionam fluorescência brilhante e localização precisa para permitir a análise da autofagia de células vivas em tipos celulares de difícil transfecção.
A autofagia, uma via de degradação induzida em células sob estresse, desempenha papéis protetores e nocivos em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e infecções. A proteína adaptadora p62 tem como alvo agregados proteicos ao autofagossoma para degradação através de seu domínio de ligação à poliubiquitina, e também funciona como uma estrutura polimérica para proteínas de sinalização, como PKCs atípicas e mTORC1. Em muitos tipos de células, a p62 normalmente existe como pontos ou salpicos, que aumentam em número e tamanho após o bloqueio do fluxo autofágico com inibidores do lisossomo. Após o início da autofagia, o complexo proteico p62-carga liga-se ao LC3 na superfície do autofagossoma, resultando na degradação deste complexo. Os construtos de DNA que codificam proteínas fluorescentes fundidas à p62 são frequentemente introduzidos nas células para monitorar a formação de agregados por microscopia de fluorescência. As partículas lentivirais LentiBriteTM RFP-p62 da EMD Millipore proporcionam fluorescência brilhante e localização precisa para possibilitar a análise da autofagia em células vivas em tipos de células de difícil transfecção.
Aplicação
Microscopia de fluorescência
Imageamento:
(Vide a Figura 1 na ficha de informações)
O tipo da célula primária, células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) foi plaqueado em uma lâmina de câmara e transduzido com partículas lentivirais em uma MOI de 40 durante 24 horas. Após a substituição do meio e 24 horas adicionais de incubação, as células foram deixadas em meio completo ou incubadas por 4 horas em EBSS contendo um inibidor de lisossomas para induzir a autofagia e inibir a degradação lisossômica dos autofagossomas. As células foram fixadas com formaldeído e montadas. As imagens foram obtidas por microscopia de fluorescência de campo largo com imersão em óleo. A RFP-p62 exibe uma distribuição citossólica difusa com pequenos pontos dispersos nas células alimentadas e uma distribuição inteiramente pontual em células em privação.
Comparação imunocitoquímica:
(vide a figura 2 na folha de informações)
De modo semelhante à Figura 1 (vide a ficha de informações), as células U2OS foram plaqueadas em uma lâmina de câmara e transduzidas com partículas lentivirais em uma MOI de 40 durante 24 horas. Após 24 horas, o meio foi substituído e as células foram, em seguida, incubadas por 24 horas. As células foram, em seguida, fixadas e coradas com um anticorpo policlonal contra p62 (N.º do cat. MABC32) seguido por uma IgG anticoelho marcada com FITC. A distribuição da RFP-p62 (vermelho) é semelhante à detectada pela coloração imunocitoquímica (verde).
Tipos de células de difícil transfecção:
(Vide a Figura 3 na ficha de informações)
O tipo da célula primária HUVEC foi plaqueado em uma lâmina de câmara e transduzido com partículas lentivirais em uma MOI de 40 durante 24 horas. Foram realizados tratamentos posteriores para células deixadas em meio completo ou células incubadas em EBSS com inibidor de lisossomas, como nas Figuras 1A e 1B (vide a ficha de informações)
Captura de imagem com lapso de tempo:
(Vide a Figura 5 na ficha de informações e no vídeo on-line)
As células U2OS foram plaqueadas em lâminas de câmara de lamínulas e transduzidas com partículas lentivirais RFP-p62, como na Figura 1 (vide a ficha de informações). Após a substituição do meio de crescimento por EBSS contendo um inibidor lisossômico, as imagens foram capturadas a cada 20 segundos por um total de 32 min. A RFP-p62 exibe uma distribuição citossólica difusa nas células alimentadas e uma distribuição pontual nas células autofágicas em privação.
Para uma visualização fluorescente ideal, recomenda-se analisar o nível de expressão alvo 24 a 48 horas após a transfecção/infecção para uma análise ideal de células vivas, pois a intensidade de fluorescência pode diminuir com o tempo, especialmente em linhagens celulares de difícil transfecção. As células infectadas podem ser congeladas após a transfecção/infecção bem-sucedida e descongeladas em cultura para reter a expressão fluorescente positiva após 24-48 horas. A duração e a intensidade da expressão fluorescente variam entre as linhagens celulares. MOIs mais altas podem ser necessárias para linhagens celulares de difícil transfecção.
Imageamento:
(Vide a Figura 1 na ficha de informações)
O tipo da célula primária, células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) foi plaqueado em uma lâmina de câmara e transduzido com partículas lentivirais em uma MOI de 40 durante 24 horas. Após a substituição do meio e 24 horas adicionais de incubação, as células foram deixadas em meio completo ou incubadas por 4 horas em EBSS contendo um inibidor de lisossomas para induzir a autofagia e inibir a degradação lisossômica dos autofagossomas. As células foram fixadas com formaldeído e montadas. As imagens foram obtidas por microscopia de fluorescência de campo largo com imersão em óleo. A RFP-p62 exibe uma distribuição citossólica difusa com pequenos pontos dispersos nas células alimentadas e uma distribuição inteiramente pontual em células em privação.
Comparação imunocitoquímica:
(vide a figura 2 na folha de informações)
De modo semelhante à Figura 1 (vide a ficha de informações), as células U2OS foram plaqueadas em uma lâmina de câmara e transduzidas com partículas lentivirais em uma MOI de 40 durante 24 horas. Após 24 horas, o meio foi substituído e as células foram, em seguida, incubadas por 24 horas. As células foram, em seguida, fixadas e coradas com um anticorpo policlonal contra p62 (N.º do cat. MABC32) seguido por uma IgG anticoelho marcada com FITC. A distribuição da RFP-p62 (vermelho) é semelhante à detectada pela coloração imunocitoquímica (verde).
Tipos de células de difícil transfecção:
(Vide a Figura 3 na ficha de informações)
O tipo da célula primária HUVEC foi plaqueado em uma lâmina de câmara e transduzido com partículas lentivirais em uma MOI de 40 durante 24 horas. Foram realizados tratamentos posteriores para células deixadas em meio completo ou células incubadas em EBSS com inibidor de lisossomas, como nas Figuras 1A e 1B (vide a ficha de informações)
Captura de imagem com lapso de tempo:
(Vide a Figura 5 na ficha de informações e no vídeo on-line)
As células U2OS foram plaqueadas em lâminas de câmara de lamínulas e transduzidas com partículas lentivirais RFP-p62, como na Figura 1 (vide a ficha de informações). Após a substituição do meio de crescimento por EBSS contendo um inibidor lisossômico, as imagens foram capturadas a cada 20 segundos por um total de 32 min. A RFP-p62 exibe uma distribuição citossólica difusa nas células alimentadas e uma distribuição pontual nas células autofágicas em privação.
Para uma visualização fluorescente ideal, recomenda-se analisar o nível de expressão alvo 24 a 48 horas após a transfecção/infecção para uma análise ideal de células vivas, pois a intensidade de fluorescência pode diminuir com o tempo, especialmente em linhagens celulares de difícil transfecção. As células infectadas podem ser congeladas após a transfecção/infecção bem-sucedida e descongeladas em cultura para reter a expressão fluorescente positiva após 24-48 horas. A duração e a intensidade da expressão fluorescente variam entre as linhagens celulares. MOIs mais altas podem ser necessárias para linhagens celulares de difícil transfecção.
Categoria de pesquisa
Apoptose e câncer
Neurociência
Apoptose e câncer
Neurociência
Subcategoria de pesquisa
Apoptose - adicional
Doenças neurodegenerativas
Apoptose - adicional
Doenças neurodegenerativas
Componentes
Lentivírus TagRFP-p62:
um frasco-ampola contendo 25 µl de partículas lentivirais com no mínimo 3 x 10E8 unidades infecciosas (IFU) por ml.
Para obter informações sobre títulos específicos do lote, vide o “título viral” específico do lote nas especificações do produto da ficha de informações.
Promotor
EF-1 (fator de alongamento-1)
Multiplicidade de infecção (MOI)
MOI = razão entre o número de partículas lentivirais infecciosas (IFU) e o número de células infectadas.
Os valores típicos de MOI para alta eficiência de transdução e intensidade de sinal estão na faixa de 20 a 40. Para esse alvo, alguns tipos de células podem exigir MOIs mais baixas (por exemplo, HT-1080, HeLa, U2OS, células-tronco mesenquimais humanas (CTMH)), enquanto outros podem exigir MOIs mais altas (por exemplo, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)).
OBSERVAÇÃO: A MOI deve ser titulada e otimizada pelo usuário final para cada tipo de célula e alvo lentiviral para atingir a eficiência de transdução e a intensidade do sinal desejadas.
um frasco-ampola contendo 25 µl de partículas lentivirais com no mínimo 3 x 10E8 unidades infecciosas (IFU) por ml.
Para obter informações sobre títulos específicos do lote, vide o “título viral” específico do lote nas especificações do produto da ficha de informações.
Promotor
EF-1 (fator de alongamento-1)
Multiplicidade de infecção (MOI)
MOI = razão entre o número de partículas lentivirais infecciosas (IFU) e o número de células infectadas.
Os valores típicos de MOI para alta eficiência de transdução e intensidade de sinal estão na faixa de 20 a 40. Para esse alvo, alguns tipos de células podem exigir MOIs mais baixas (por exemplo, HT-1080, HeLa, U2OS, células-tronco mesenquimais humanas (CTMH)), enquanto outros podem exigir MOIs mais altas (por exemplo, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)).
OBSERVAÇÃO: A MOI deve ser titulada e otimizada pelo usuário final para cada tipo de célula e alvo lentiviral para atingir a eficiência de transdução e a intensidade do sinal desejadas.
Qualidade
Avaliado pela transdução de células HT-1080 e imageamento fluorescente realizados para avaliação da eficiência de transdução.
forma física
Precipitação de PEG
Armazenamento e estabilidade
Armazenamento e manuseio
O lentivírus é estável por pelo menos 4 meses a partir da data de recebimento, quando armazenado a –80 °C. Após o primeiro descongelamento, coloque imediatamente no gelo e congele em alíquotas de trabalho a –80°C. As alíquotas congeladas podem ser armazenadas por, pelo menos, 2 meses. Mais congelamentos e descongelamentos podem resultar na diminuição do título viral e da eficiência da transdução.
NOTA DE SEGURANÇA IMPORTANTE
Não há relatos de que os vetores lentivirais de replicação defeituosa, como o vetor de 3ª geração fornecido neste produto, causem doenças em seres humanos ou em animais. No entanto, os lentivírus podem se integrar ao genoma da célula hospedeira e, dessa forma, representam algum risco de mutagênese insercional. O material pertence ao grupo de risco 2 e deve ser manuseado sob controles de nível de biossegurança 2 (BSL2). Uma discussão detalhada da biossegurança de vetores lentivirais é fornecida em Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
O lentivírus é estável por pelo menos 4 meses a partir da data de recebimento, quando armazenado a –80 °C. Após o primeiro descongelamento, coloque imediatamente no gelo e congele em alíquotas de trabalho a –80°C. As alíquotas congeladas podem ser armazenadas por, pelo menos, 2 meses. Mais congelamentos e descongelamentos podem resultar na diminuição do título viral e da eficiência da transdução.
NOTA DE SEGURANÇA IMPORTANTE
Não há relatos de que os vetores lentivirais de replicação defeituosa, como o vetor de 3ª geração fornecido neste produto, causem doenças em seres humanos ou em animais. No entanto, os lentivírus podem se integrar ao genoma da célula hospedeira e, dessa forma, representam algum risco de mutagênese insercional. O material pertence ao grupo de risco 2 e deve ser manuseado sob controles de nível de biossegurança 2 (BSL2). Uma discussão detalhada da biossegurança de vetores lentivirais é fornecida em Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Informações legais
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Código de classe de armazenamento
10 - Combustible liquids
Classe de risco de água (WGK)
WGK 2
Certificados de análise (COA)
Busque Certificados de análise (COA) digitando o Número do Lote do produto. Os números de lote e remessa podem ser encontrados no rótulo de um produto após a palavra “Lot” ou “Batch”.
Já possui este produto?
Encontre a documentação dos produtos que você adquiriu recentemente na biblioteca de documentos.
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