Anti-FLAG^® M2 Magnetperlen

• Anti-FLAG^® M2 Magnetperlen für das Einfangen von FLAG^® Tag Proteinen
• Probenvorbereitung und Affinitätsaufreinigung
• Elektrophorese und Western Blotting
• Vergleich der Elutionstechniken für FLAG-markierte Fusionsproteine
• FLAG^® Tag Antikörper, Kontrollproteine und Tools für die Affinitätsaufreinigung

Anti-FLAG^® M2 Magnetperlen für das Einfangen von FLAG^® Tag Proteinen

Anti-FLAG® M2 Magnetperlen bieten ein einfaches, schnelles und komfortables Verfahren für den Nachweis und den Capture-Schritt von Fusionsproteinen mit der FLAG^® Peptidsequenz. Die Perlen bestehen aus einem aus der Maus stammenden monoklonalen Anti-FLAG^® Antikörper Klon M2, der an superparamagnetische, mit Eisen imprägnierte 4 %-Agaroseperlen (Beads) gebunden ist. Der anti-FLAG^® M2 Antikörper erkennt die FLAG^® Octapeptidsequenz (N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys-C) am N-Terminus, Met-N-Terminus oder C-Terminus eines in Säuger- und Bakterienzellen exprimierten Fusionsproteins.

Es gibt verschiedene Optionen für die Elution eines Fusionsproteins bei Verwendung von anti-FLAG^® M2 Magnetperlen, darunter Peptidkonkurrenz, niedriger pH-Wert und SDS-PAGE-Probenpuffer. In diesem Beitrag haben wir die drei Elutionsmethoden für das Kontrollfusionsprotein N-terminales Met-3XFLAG^®-BAP (P7582) oder C-terminales FLAG^®-BAP (P7457) verglichen, das allein inkubiert oder in ein A431-Zelllysat dotiert wurde.

Die Elution durch Konkurrenz mit 3X FLAG^® Peptid (F4799) sowie ein saurer pH-Wert (2,5-3,0) boten die effizientesten Elutionsbedingungen für die Anti-FLAG^® M2 Magnetperlen. Bei der Elution mit 3X FLAG^® Peptid benötigten die Proben eine 30-minütige Inkubationszeit mit einer Lösung von 100-150 ng/µl FLAG-Peptid, während die Proben für die pH-Elution eine Inkubationszeit unter 10 Minuten mit 0,1 M Glycin HCl und einem pH-Wert zwischen 2,5 und 3,0 benötigten. Wir haben darüber hinaus aufgezeigt, dass die Elution bei einem hohen pH-Wert (8-10) mit dieser Art von Perlen (Beads) nicht hinreichend ist und dass durch längere Inkubationszeiten mit Glycin-HCl die Menge des eluierten Proteins nicht erhöht wird. Schließlich haben wir auch die mit SDS-PAGE-Probenpuffer eluierten Proben verglichen. Diese Elutionsbedingung war einfach, aber da der M2-Antikörper durch das Vorhandensein von SDS im Ladepuffer denaturiert wird, zeigte die Analyse durch Gelelektrophorese Banden auf, die den Schwer- und Leichtketten des anti-FLAG^® Antikörpers entsprechen.

Probenvorbereitung und Affinitätsaufreinigung

Die anti-FLAG^® M2 Magnetperlen (M8823) wurden gründlich resuspendiert und 20 µl der Suspension (einschließlich 10 µl des gepackten Harzes) wurden in mehrere 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert. Die Röhrchen wurden in einen PureProteome™ Magnetständer (LSKMAGS08) gestellt und der Überstand wurde entfernt und verworfen, nachdem alle Perlen zum Magneten gewandert sind. Das Harz wurde durch Zugabe von 200 µl Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) äquilibriert, gefolgt von der Inkubation der Probe (Abbildung 1).

Abbildung 1. Protokoll für die Immunpräzipitation in kleinem Maßstab mit anti-FLAG^® M2 Magnetperlen unter Einsatz von drei Elutionsmethoden.

Die Proben wurden durch Verdünnen des C-Terminalen FLAG-BAP™ Fusionsproteins oder des N-Terminalen FLAG-BAP™ Fusionsproteins auf eine Endkonzentration von 0,6 ng/µl (300 ng Protein in 500 µl Probe) hergestellt. Das FLAG-BAP™ Fusionsprotein wurde darüber hinaus in der gleichen Endkonzentration in ein A431-Zelllysat dotiert, das auf eine Gesamtprotein-Lysatkonzentration von 1,6 ng/µl verdünnt war. Um die Perlen in Suspension und in Kontakt mit 500 µl der Probe zu halten, wurden die Röhrchen zwischen 3 Stunden und über Nacht mit einem End-over-End-Rotor inkubiert. Nach der Inkubation wurden alle Röhrchen in den Magnetständer gestellt, der Überstand wurde entfernt und anschließend dreimal mit 500 µl TBS gewaschen. Das Protein wurde in drei Verfahren eluiert:

1. Die Elution durch Konkurrenz mit dem 3X FLAG^® Peptid erfolgte bei Raumtemperatur durch 30-minütige Inkubation der Perlen mit 50 µl einer 100 ng/µl-Peptidlösung unter Einsatz eines Orbitalschüttlers.
2. Bei Proben, die mit SDS-PAGE-Probenpuffer eluiert wurden, wurden 20 µl 2X Laemmli-Probenpuffer (ohne DTT) hinzugefügt und die Röhrchen vor dem Beladen eines Gels 10 min bei 95 °C gekocht.
3. Die Elution nach pH-Wert erfolgte bei Raumtemperatur durch Inkubation der Perlen für 5 bis 30 Minuten (je nach Versuch) mit 50 µl Glycin HCl (pH 2,5-3,0) oder Glycin NaOH (pH 8,0-10) unter Einsatz eines Orbitalschüttlers.

Nach der Inkubation wurden alle Röhrchen in das Magnetgestell gestellt und der Überstand (eluierte Fraktion) in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die mit niedrigem pH-Wert eluierten Proben wurden sofort durch Zugabe von 10 µl 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl pH 8,0 Lösung neutralisiert.

Elektrophorese und Western Blotting

Die Proben wurden mit einem 4-12 % SDS-PAGE-Gel getrennt, das 30 Minuten lang bei 200 Volt lief. Die Gele wurden mit Coomassie gefärbt oder auf eine Immobilon^®-P PVDF-Membran überführt. Nach dem Transfer wurden die Blots 1 Stunde mit 2 % fettfreier Trockenmilch (NFDM) blockiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit dem anti-FLAG^® M2-Antikörper (F3165), der 1:1000 in Blockierungspuffer verdünnt wurde. Die Blots wurden dreimal in TBS-T gewaschen und 1 Stunde mit 1:50.000 verdünntem Ziegen-Anti-Maus-IgG HRP (AP124P) inkubiert.

Für den Nachweis wurden alle Blots 5 Minuten mit Immobilon^® Forte Western HRP-Substrat inkubiert und die Bilder wurden mit einem digitalen Bildgebungssystem aufgenommen.

Vergleich der Elutionstechniken für FLAG-markierte Fusionsproteine

Zwei Kontrollfusionsproteine, N-Terminales FLAG-BAP™ und C-Terminales FLAG-BAP™, sowie ein A431-Zelllysat, das mit N-Terminus FLAG-BAP™ dotiert war, wurden mit anti-FLAG^® M2-Magnetperlen inkubiert und unter Einsatz der drei verschiedenen Elutionsverfahren eluiert. In Abbildung 2 ist dargestellt, dass die Proteine in allen drei Verfahren effizient eluiert wurden, wobei zusätzliche Banden, die den Schwer- und Leichtketten des anti-FLAG^® M2 Antikörpers entsprechen, sichtbar waren, wenn SDS-Ladepuffer als Elutionsmittel verwendet wurde.

Abbildung 2. Vergleich der drei Elutionsverfahren, die mit anti-FLAG^® M2 Magnetperlen verwendet werden. St=Ausgangsmaterial; 3X=3X FLAG^® Peptid, pH=2,5 Glycin

Glycin-HCl (pH-Wert 2,5-3,0)- und Glycin-NaOH (pH-Wert 8-10,6)-Lösung wurden verwendet, um acht Proben zu eluieren, die A431-Zelllysat enthielten, das mit N-terminalem FLAG-BAP™ Kontrollprotein dotiert war. Die eluierten Fraktionen wurden durch Elektrophorese aufgetrennt und einem Elektroblotting unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass anti-FLAG^® M2 Magnetperlen nur unter sauren Bedingungen eluiert werden können (Abbildung 3).

Abbildung 3. Elution durch einen breiten pH-Bereich (2,5 bis 10,6), verglichen mit der Elution mit 3X FLAG^® Peptid. Links: Coomassie-gefärbtes Gel. Rechts: Immunblot mit Anti-FLAG^® M2 Antikörper.

Um zu zeigen, dass die Elution durch den pH-Wert lediglich eine Inkubationszeit von 10 Minuten mit den Perlen erfordert, wurden für verschiedene Proben unterschiedliche Inkubationszeiten von 0,1 M Glycin HCl pH 2,5, 2,8 und 3,0 eingesetzt. In Abbildung 4 wird dargestellt, dass die Ausbeute unabhängig von der Inkubationszeit vergleichbar und dem Wert bei der Elution durch Konkurrenz mit 3X-FLAG-Peptid ähnlich war.

Abbildung 4. Vergleich der eluierten Fraktionen nach einer Inkubation von 5 bis 30 Minuten mit Glycin. Links: Coomassie-gefärbtes Gel. Rechts: Immunblot mit Anti-FLAG^® M2 Antikörper.

FLAG^® Tag Antikörper, Kontrollproteine und Tools für die Affinitätsaufreinigung

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