In der RT-qPCR oder quantitativen PCR mit reverser Transkription werden die Effekte der reversen Transkription und der quantitativen PCR oder Echtzeit-PCR für die Amplifikation und den Nachweis spezifischer Ziele kombiniert. Die RT-qPCR wird in vielen Anwendungen eingesetzt, darunter die Quantifizierung der Genexpressionsniveaus, die Validierung der RNA-Interferenz (RNAi) und der Nachweis von Krankheitserregern wie Viren. Übliche Ansätze zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals, das zur Messung der DNA-Menge in dieser Technik verwendet wird, sind entweder Hydrolysesonden wie TaqMan® Sonden oder ein Bindungsfarbstoff für doppelsträngige DNA wie der SYBR® Green-Farbstoff.
Was ist RT-qPCR?
Bei der quantitativen PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) geht es um den Nachweis und die Quantifizierung von RNA. Das Verfahren erfolgt durch reverse Transkription der Gesamt-RNA oder mRNA in komplementäre DNA (cDNA) durch das Enzym reverse Transkriptase, gefolgt von der Amplifikation und dem Nachweis spezifischer Ziele dieser cDNA durch eine Technik, die als quantitative PCR (qPCR) oder Echtzeit-PCR bezeichnet wird. Bei jedem Zyklus dieser PCR wird die DNA-Menge in Echtzeit mit einer Vielzahl von Fluoreszenzchemikalien gemessen. Die gebräuchlichsten Ansätze zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals sind die Verwendung von Hydrolysesonden wie TaqMan® Sonden oder eines Bindungsfarbstoff für doppelsträngige DNA, wie SYBR® Green.
Die Auswahl der Fluoreszenzchemie hängt von Faktoren wie der Anwendung, den Kosten und der Frage ab, ob es sich um einen Singleplex- oder Multiplex-Assay handelt. DNA-bindende Farbstoffe werden für Singleplex-Assays mit geringem Durchsatz bevorzugt, da sie einfacher zu planen sind, weniger Zeit für die Einrichtung benötigt wird und sie kostengünstiger sind. Fluoreszenzsonden werden üblicherweise in Multiplex-Assays mit hohem Durchsatz eingesetzt, die eine höhere Spezifität erfordern.
Weitere Informationen zur qPCR finden Sie in unserem Technischen Leitfaden zur quantitativen PCR
Anwendungen der RT-qPCR
Die RT-qPCR kann in einer Vielzahl Anwendungen eingesetzt werden. Die RT-qPCR-Technik wird verwendet, um:
- Das Niveau der Genexpression zu quantifizieren
- RNAi zu validieren, um den Funktionsverlust selektiver Gene zu untersuchen
- Pathogene wie Viren zur Diagnose von Infektionskrankheiten nachzuweisen
- Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) nachzuweisen
Einstufige RT-qPCR vs. zweistufige RT-qPCR
RT-qPCR wird entweder in einem einstufigen oder einem zweistufigen Assay durchgeführt. Bei der Auswahl der richtigen RT-qPCR-Methode müssen verschiedene Faktoren wie Kosten, Anwendung und Assay-Typ berücksichtigt werden.
Abbildung 1.Diagramm zum Vergleich zwischen einstufigem und zweistufigem RT-qPCR-Workflow.
Einstufige RT-qPCR
Bei der einstufigen RT-qPCR werden die reverse Transkription oder die cDNA-Synthese und die qPCR in einem einzelnen Röhrchen durchgeführt, wobei sequenzspezifische Primer für die Amplifikation eines bestimmten Ziels eingesetzt werden. Gentechnisch veränderte reverse Transkriptasen werden häufig in einstufigen Assays eingesetzt, da sie höheren Temperaturen standhalten, die für die Hybridisierung sequenzspezifischer Primer erforderlich sind. Ein einstufiger Assay wird bevorzugt, wenn eine wiederholte Quantifizierung desselben Gens durchgeführt wird, insbesondere bei Hochdurchsatz- und Diagnoseanwendungen. Eine weitere Überlegung bei der Auswahl einstufiger Assays ist die Qualität und Knappheit der RNA. Da die während der Reaktion synthetisierte cDNA nicht separat als Aliquot gespeichert werden kann, sind möglicherweise mehrere Proben der ursprünglichen RNA erforderlich, um den Assay zu wiederholen.
Zweistufige RT-qPCR
Bei der zweistufigen RT-qPCR werden die reverse Transkription und die qPCR-Reaktionen in getrennten Röhrchen mit separaten Puffern und Reagenzien durchgeführt. In zweistufigen Assays können zufällige Hexamere, Oligo-dT-Primer und/oder genspezifische Primer verwendet werden. Getrennte Puffer und Reagenzien ermöglichen mehr Flexibilität bei der Auswahl der Enzyme für die reverse Transkriptase und der PCR-Reagenzien und bieten mehr Möglichkeiten zur Optimierung und Verbesserung der Amplifikationseffizienz schwieriger Templates. Die stabilere cDNA, die im ersten Schritt synthetisiert wird, kann weiter konzentriert und/oder aufgereinigt werden, um sie entweder für eine spätere Verwendung aufzubewahren oder für die Quantifizierung mehrerer Gene aus der gleichen Probe einzusetzen.
Weitere Informationen zur PCR-Assay-Optimierung finden Sie unter Assay-Optimierung und -Validierung.
Produkte für Hochdurchsatzanwendungen in der einstufigen RT-qPCR
Durch unsere einstufigen RT-qPCR-Produkte wird die Wirkung der reversen Transkriptase mit dem Hot-Start-Taq-Antikörper in praktischen ReadyMixTM-PCR-Reaktionsmischungen für sondenbasierte SYBR® Green-basierte Anwendungen kombiniert. Unabhängig von schwierigen Sekundärstrukturen oder schwieriger Nachweischemie sind unsere ReadyMixTM-PCR-Reaktionsmischungen speziell formuliert, um in weniger Schritten hervorragende Ergebnisse zu erzielen.
Unsere Produkte fügen sich problemlos in Ihren PCR-Workflow ein. Und mit einer Vielzahl zuverlässiger Produkte für einstufige RT-qPCR-Versuche treffen Sie immer die richtige Wahl. Entdecken Sie die KiCqStart® Produkte und finden Sie einen ReadyMix™ Mastermix, der für Ihr Gerät optimiert ist. Oder entdecken Sie unsere JumpStart™ Optionen für Kits, die für Ihre Versuchsanforderungen optimiert werden können. Für die einstufige RNA-Quantifizierung mit hohem Durchsatz und schnellem Zyklus unter Verwendung sequenzspezifischer fluorogener Sonden wählen Sie das KAPA PROBE FAST Universal-Kit. Entscheiden Sie sich vertrauensvoll für eines unserer RT-qPCR-Produkte, ohne Kompromisse bei der Qualität einzugehen.
KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ – Kompatibel mit allen gängigen qPCR-Geräten
Unsere KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ Reagenzien verfügen über einen strengen Hot-Start-Mechanismus für höhere Spezifität und sind so formuliert, dass sie gegenüber PCR-Inhibitoren in den Proben äußerst tolerant sind. Diese hochsensiblen, gebrauchsfertigen Mastermischungen sind einfach zu handhaben und enthalten alle erforderlichen Basiskomponenten für qPCR oder RT-qPCR. Fügen Sie einfach Ihre Primer, Sonde und Wasser hinzu, um den Assay-Cocktail zu vervollständigen. Dieses Produkt ist ideal für schnelle oder konventionelle qPCR
Erfahren Sie mehr über die Gerätekompatibilität mit diesen Produkten in unserer vollständigen Gerätekompatibilitätsübersicht oder entdecken Sie unsere kundenspezifischen qPCR-Sonden.
JumpStart™ Taq ReadyMix™ – Optimierbar für alle wichtigen qPCR-Geräte
Unsere JumpStart™ Taq ReadyMix™ Produkte für die RT-qPCR kombinieren die Vorteile der Moloney Maus-Leukämievirus Reverse Transkriptase (M-MLV RT) und unserer JumpStart™ Antikörper-inaktivierten Taq-Polymerase. Die robuste M-MLV RT ist in der Lage, auch bei erhöhten Temperaturen durch schwierige Sekundärstrukturen zu transkribieren, während unsere JumpStart™ Taq-Polymerase eine höhere Spezifität und Sensitivität als Standard-Taq-Polymerase bietet. Diese Produkte sind sowohl mit Röhrchen- und Plattengeräten als auch mit Kapillargeräten kompatibel.
Sparen Sie 20 % beim Kauf unseres RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200), indem Sie den Code SGX an der Kasse verwenden. Gültig bis 31. Januar 2021.
KAPA PROBE FAST – Kompatibel mit allen auf fluorogenen Sonden basierenden Technologien
Das KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Mastermix Universal-Kit ist eine empfindliche und praktische Lösung für die Echtzeit-PCR unter Verwendung von RNA als Template. Das Kit ist für die Quantifizierung von RNA in einem Schritt mit hohem Durchsatz und schnellem Zyklus unter Verwendung sequenzspezifischer fluorogener Sonden konzipiert. Es ist mit allen auf fluorogenen Sonden basierenden Technologien kompatibel, darunter Hybridisierungssonden (z. B. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Sonden), Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan® Sonden) und Verdrängungssonden (z. B. Molecular Beacons).
Bei diesem Kit handelt es sich um einen gebrauchsfertigen Cocktail, der alle Komponenten außer Primer, Sonde(n) und Template für die Schnellzyklus-, sondenbasierte Echtzeit-PCR enthält. Das Kit enthält KAPA PROBE FAST qPCR Mastermix, ROX High und ROX Low Referenzfarbstoffe, KAPA RT-Mix und dUTP.
ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit – Kompatibel mit allen gängigen qPCR-Geräten
Die im Kit enthaltene ABScript II Reverse Transkriptase ermöglicht eine zuverlässige reverse Transkription von RNA. Nach der reversen Transkription wird die Hot-Start-Version der Taq-Polymerase bei 95 °C aktiviert und gleichzeitig die ABScript II Reverse Transkriptase inaktiviert. In der sequenziellen PCR-Reaktion spaltet die 5′-3′-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase die hybridisierte Sonde, trennt den Reporter vom Quencher und setzt ein Fluoreszenzsignal frei.
Das ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit ist ein gebrauchsfertiges Kit für reverse Transkription und anschließende sondenbasierte qPCR in einem einzelnen Röhrchen. Das flexible Format dieses Kits umfasst zwei separate 50X Konzentrationen des ROX-Farbstoffs (passive Referenz), die je nach Bedarf des jeweiligen qPCR-Geräts hinzugefügt werden können.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.
Zweistufige RT-qPCR-Produkte für höhere Flexibilität
Wir bieten alle Reagenzien für die reverse Transkription und die anschließende PCR-Analyse der synthetisierten cDNA in separaten Röhrchen an, damit Ihre Versuche flexibler gestaltet werden können. Integrieren Sie unsere zweistufigen RT-qPCR-Produkte vertrauensvoll in Ihren PCR-Workflow, ohne Kompromisse in Bezug auf die Flexibilität einzugehen. Mit den verschiedenen Optionen, die für unsere zuverlässigen PCR-Produkte zur Verfügung stehen, treffen Sie die richtige Wahl.
cDNA-Synthese-Kits und -Mischungen
Um Ihren Anforderungen an die reverse Transkription gerecht zu werden, können Sie aus verschiedenen Enzymtypen und Verpackungsoptionen wählen. Alle diese Produkte enthalten die für die Erststrangsynthese erforderlichen Reagenzien und sind als Kits mit separaten Reagenzien für die Optimierung oder als Komplettmischungen für die schnelle und komfortable Erststrangsynthese erhältlich.
RT Enzyme – Reverse Transkriptasen
Wählen Sie aus unserer Sammlung von RT-Enzymen ein Enzym aus, das der Komplexität Ihres RNA-Transkripts entspricht. Unsere Produkte umfassen Standard-Vogelmyeloblastosevirus (AMV) und Moloney-Maus-Leukämievirus (M-MLV) reverse Transkriptasen sowie erweiterte Versionen der vorgenannten Produkte für eine höhere Empfindlichkeit.
Weitere Informationen zur RT-qPCR-Fehlerbehebung finden Sie auf unserer Seite zur Fehlerbehebung in der RT-PCR / RT-qPCR.
qPCR-Kits
Diese ReadyMixTM Produkte enthalten alle für die qPCR erforderlichen Komponenten. Fügen Sie einfach die fluoreszierende Nachweischemie, Primer und Template hinzu.
Sondenbasierte qPCR
Die sondenbasierte qPCR beruht auf dem sequenzspezifischen Nachweis eines gewünschten PCR-Produkts. Im Gegensatz zu SYBR® Green-basierten qPCR-Methoden, in welchen die gesamte doppelsträngige DNA nachgewiesen wird, wird bei der sondenbasierten qPCR eine fluoreszenzmarkierte zielspezifische Sonde verwendet, was zu einer erhöhten Spezifität und Sensitivität führt. Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen erhältlich, sodass mehrere Primer zur gleichzeitigen Amplifikation vieler Sequenzen verwendet werden können.
SYBR® Green-basierte qPCR
SYBR® Green I ist ein häufig verwendeter fluoreszierender DNA-Bindungsfarbstoff, der an alle doppelsträngigen DNA bindet. Der Nachweis wird durch Messung des Anstiegs der Fluoreszenz während des Zyklus überwacht. SYBR® Green I hat ein Anregungs- und Emissionsmaximum von 494 nm bzw. 521 nm. Die Spezifität unseres SYBR® Green-basierten qPCR-Nachweises wird durch den Einsatz einer Hot-Start-vermittelten Taq-Polymerase wie JumpStart™ Taq erheblich verbessert.
In diesem kurzen Video erfahren Sie mehr über SYBR® Green-basierte qPCR.
MicroRNA-basierte RT-qPCR
In unserer MystiCq® Produktlinie finden Sie die microRNA-Produkte für die reverse Transkription, die Sie benötigen.
MystiCq® MicroRNA RT-qPCR-SystemR
MystiCq® microRNA-Reagenzien bieten einen vollständigen SYBR® Green RT-qPCR-Workflow für die Quantifizierung der Expression in nur drei Schritten:
- Isolierung
- cDNA-Synthese
- Quantifizierung durch Amplifikation
Erfahren Sie mehr über den MystiCq®-Workflow auf unserer MystiCq®-Produktseite. Diese Produkte zeichnen sich durch folgende Merkmale aus:
- Über 1.400 vordefinierte und im Nasslabor getestete Primerpaare, die nur auf reife microRNA abzielen
- Konvertierung aller microRNA, wodurch nahezu unbegrenzte Messwerte aus einer einzelnen Probe möglich werden
- Auswahl von drei verschiedenen Produkten für die Isolierung von microRNA
qPCR-Assay-Designs und Reagenzien für die SARS-CoV-2-Forschung
Wir setzen uns dafür ein, Forschenden zuverlässige Informationen und Tools zur Verfügung zu stellen, um den Kampf gegen COVID-19 (SARS-CoV-2) zu unterstützen. Als Reaktion auf den Bedarf der Wissenschaftsgemeinschaft an SARS-CoV-2-spezifischen Reagenzien und Protokollen haben unsere Wissenschaftler die RNA-basierten einstufigen RT-qPCR-Kits für den SARS-CoV-2-Zielnachweis evaluiert. Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.
Versuchsaufbau und Methoden
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um festzustellen, ob unsere einstufigen RT-qPCR-Kits SARS-CoV-2 nachweisen können. Der Test wurde nach dem CDC-Protokoll für den SARS-CoV-2-Nachweis durchgeführt, wobei synthetisierte SARS-Cov-2-RNA als Template verwendet wurde, verdünnt in 105, 104, 103, 102 und 10 Kopien. Die Testprobe enthielt das Template, die Reagenzien aus jedem Kit, zielspezifische DNA-Primer / TaqMan® Sonden-Sets für N1 und N2 (N, Nukleokapsid-Gen). NTC-Proben (Negativkontrolle) wurden ebenfalls in jeden Assay einbezogen.
Tabelle 2. Die Primer- und Sonden-Sets für den spezifischen Nachweis von SARS-CoV-2 (N1- und N2-Assays). Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.
Testergebnisse
A: N1-Assay
B: N2-Assay
Abbildung 2.SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung von ReadyMix™ für die quantitative RT-PCR (Art. Nr. QR200) für die Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B).
Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 2 wurden mit dem ReadyMix™ für die quantitative RT-PCR (Art. Nr. QR200) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 102 Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet
A: N1-Assay
B: N2-Assay
Abbildung 3.SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung von KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Art. Nr. KCQS07) für Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B)
Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 3 wurden mit dem KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Art. Nr. KCQS07) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 10 Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet.
A: N1-Assay
B: N2-Assay
Abbildung 4.SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung des KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Mastermix (2X) Universal-Kits (Art. Nr. KK4752) für Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B).
Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 4 wurden mit dem KAPA-PROBE-FAST One-Step-qRT-PCR-Mastermix (2X) Universal-Kit (Art.-Nr. KK4752) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 102 Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet.
A: N1-Assay
B: N2-Assay
Abbildung 5.SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung von ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (Art. Nr. RK20407) für Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B)
Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 5 wurden mit dem ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (Art. Nr. RK20407) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 10 Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet.
Schlussfolgerung
Die vorgenannten Ergebnisse zeigen, dass unsere One-Step RT-qPCR-Reagenzien und Kits ideal für den SARS-CoV-2 Zielnachweis in der SARS-CoV-2 Forschung sind. Auf der Grundlage dieser Informationen kann der Nachweis in Assays mit den One-Step-RT-qPCR-Reagenzien von nur 100 Kopien oder in einigen Fällen sogar nur 10 Kopien des RNA-Templates erfolgen.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.
Die in diesem technischen Artikel vorgestellten unveröffentlichten Daten stammen aus der internen Forschung.
Weitere Informationen über RT-qPCR-Produkte für den Nachweis von SARS-CoV-2 finden Sie unter Sigma-Aldrich.com/covid19.
TRI Reagent® für die Gesamt-RNA-Isolierung
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TRI Reagent® wurde in mehreren Forschungsstudien für die Inaktivierung von Viren und die Extraktion viraler RNA zum Nachweis von SARS-CoV-2 mittels RT-qPCR-Assays verwendet.1,2,3 Es hat sich als ideal für die Isolierung und Lagerung von mi-RNA bei -80 0C über längere Zeiträume erwiesen.4 Es wurde für die Extraktion feliner und caniner Coronavirus-RNA verwendet, die dann in RT-PCR-Assays eingesetzt wurde.5,6 Es wurde auch für die Isolierung zytoplasmatischer RNA aus mit SARS-CoV infizierten Vero-Zellen verwendet. 7
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.
Literatur
*Bei diesem Artikel handelt es sich um einen Vorabdruck, der noch keinem Peer-Review unterzogen wurde. In dem Artikel wird über neue medizinische Forschung, die noch nicht ausgewertet wurde, berichtet. Er soll daher nicht als Richtschnur für die klinische Praxis dienen.
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