Protokolle für die Anhaftung, Löslichkeit und Stabilität von Kollagen

Wichtige Punkte, die vor dem Beginn zu beachten sind

1. Sicherstellen, dass die Zellen gesund und in ausreichender Zahl vorhanden sind.
2. Kollagenlösungen können durch Dialyse in einer Lösung aus 0,25 % Essigsäure und 0,5 % Chloroform sterilisiert werden.
3. Wir raten davon ab, die Kollagenlösung durch Membranfiltration zu sterilisieren. Wir mussten feststellen, dass bei dieser Methode erhebliche Proteinverluste auftreten.
4. Die Beschichtung von Kunststoffschalen für Gewebekulturen kann durch Lufttrocknung erfolgen. Getrocknete beschichtete Schalen können durch Bestrahlung mit UV-Licht in einer sterilen Kulturhaube oder durch Spülen mit 70 % Ethanol sterilisiert werden.  
5. Die Konzentration der Oberflächenabdeckung kann abhängig von den zu kultivierenden Zellen unterschiedlich sein. Die optimalen Anhaftungsbedingungen müssen für jede Zelllinie und jede Anwendung bestimmt werden. Empfohlene Konzentrationen sind in Tabelle 1 dargestellt.
6. Die Kulturplatten/Deckgläser nach dem Beschichten nicht zu stark trocknen, da hierdurch die Anhaftung der Zellen beeinträchtigt wird.
7. Alle Schritte in den Protokollen müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

Beschichtungsprotokoll für Kollagen Typ I Kulturgefäße

1. Kollagen in Essigsäure (siehe Tabelle 1) geben, um eine 0,1 % (w/v) Kollagenlösung zu erhalten. Bei Raumtemperatur 1-3 Stunden rühren, bis es sich aufgelöst hat. Die Kollagenlösung soll 10-fach verdünnt werden, um eine Gebrauchskonzentration von 0,01 % zu erhalten.
2. Wir empfehlen, die Kollagenlösung in eine Glasflasche mit Schraubverschluss umzufüllen und vorsichtig Chloroform auf den Boden zu schichten. Die zu verwendende Menge an Chloroform soll etwa 10 % des Volumens der Kollagenlösung betragen. NICHT SCHÜTTELN ODER RÜHREN. Über Nacht gekühlt stehen lassen. Die oberste Schicht mit der Kollagenlösung aseptisch entfernen.
3. Die Schalen mit den in Tabelle 1 empfohlenen Konzentrationen beschichten. Das Protein mehrere Stunden bei Raumtemperatur, 37 °C oder über Nacht bei 2-8 °C binden lassen.
4. Überschüssige Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche entfernen und über Nacht trocknen lassen.
5. Wenn die Kollagenlösung nicht steril ist, kann die getrocknete, beschichtete Oberfläche über Nacht unter UV-Licht in einer sterilen Gewebekulturhaube sterilisiert werden.
6. Vor dem Einbringen von Zellen und Medium mit sterilem Wasser in Gewebekulturqualität oder einer ausgewogenen Salzlösung spülen.

Kollagen Typ II und IV Beschichtungsprotokoll für Kulturgefäße

1. Kollagen Typ II und IV können in einer Konzentration von 0,5–2,0 mg/ml in Essigsäure rekonstituiert werden (siehe Tabelle 1). Mehrere Stunden bei 2–8 °C lösen, dabei gelegentlich schwenken.
2. Die Gewebekultur-Kunststoffschalen durch Lufttrocknung beschichten. Alternativ können die beschichteten Kulturgefäße über Nacht bei 2–8 °C (oder mehrere Stunden bei 37 °C) vorinkubiert werden.
3. Getrocknete beschichtete Schalen können durch Bestrahlung mit UV-Licht in einer sterilen Kulturhaube oder durch Spülen mit 70 % Ethanol sterilisiert werden.

Alternativ dazu bieten wir gebrauchsfertige, kollagenbeschichtete 96-Well-Streifen an (Tabelle 1).

Tabelle 1. Kollagene für die Zellanhaftung

Produkt-Nr.	Beschreibung	Beschichtungskonzentration	Lösen in
11179179001	Kollagen aus Rattenschwanzsehnen	5 μg/cm2	Sterile Essigsäure 0,2 %
08-110	ECL-Zellanhaftungsmatrix	5 μg/cm2	Steriles Basalmedium (ohne Serum)
C0543	Kollagen aus der Basalmembran des murinen Engelbreth-Holm-Swarm-Sarkoms	6–10 μg/cm2	Essigsäure 0,25 %
C2124	Kollagenlösung aus Rinderhaut	6–10 μg/cm2	Sterile PBS
C2249	Kollagenlösung aus humanen Fibroblasten	6–10 μg/cm2	Sterile PBS
C3867	Kollagen, Typ I Lösung aus Rattenschwanz	6–10 μg/cm2	Steriles Wasser
C4243	Kollagenlösung aus Rinderhaut	6–10 μg/cm2	Sterile PBS
C5533	Kollagen aus menschlicher Plazenta	6–10 μg/cm2	Essigsäure 0,25 %
C6745	Kollagen Typ IV aus menschlicher Zellkultur	6–10 μg/cm2	Sterile HBSS
C7661	Kollagen aus Rattenschwanz	6–10 μg/cm2	Essigsäure 0,1 M
C8919	Kollagen aus Kalbshaut	6–10 μg/cm2	Steriles Wasser
C9301	Kollagen aus Hühnerbrust-Knorpel	6–10 μg/cm2	Essigsäure 0,25 %
C9791	Kollagen aus Kalbshaut	6–10 μg/cm2	Essigsäure 0,1 M
234184-M	Kollagen, Typ II, Rinder-Gelenkknorpel	0,2 - 2 µg/cm2	500 mM Essigsäure
08-115	Kollagen Typ I, Rattenschwanz	10 µg/cm2	Sterile PBS
122-20	Kollagen-Beschichtungslösung aus Rattenschwanz (20 ml)		Gebrauchsfertig
ECM104	Millicoat beschichtete Streifen aus menschlichem Kollagen Typ I (96 Wells)		Gebrauchsfertig
ECM105	Millicoat beschichtete Streifen aus menschlichem Kollagen Typ IV (96 Wells)		Gebrauchsfertig

Kollagen-Gele

Produkte, die für die Herstellung von Kollagengelen geeignet sind, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2. Kollagene für die Gelherstellung

Produkt-Nr.	Beschreibung
11179179001	Kollagen aus Rattenschwanzsehnen
234138	Kollagen, Typ I, menschliche Haut
234154	Kollagen, Typ IV, menschliche Plazenta
CC050	Menschliches Kollagen Typ I
CC052	Menschliches Kollagen Typ II
CC054	Menschliches Kollagen Typ III
CC076	Menschliches Kollagen Typ IV
CC077	Menschliches Kollagen Typ V
CC078	Kollagen Typ III, aufgereinigtes Rinderprotein
CC083	Rinderkollagen Typ IV
CC086	Rinderkollagen Typ VI
5006	PureCol™
5074	PureCol™ EZ Gel-Lösung
5168	Rinderkollagen
234149	Kollagen, Typ I, menschliche Plazenta

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

Warum sieht das Fläschchen mit der Kollagenlösung milchig aus oder enthält Partikel?

Aufgrund von Quervernetzungen und Sequenzvariabilität sowie strukturellen Veränderungen, die während der Isolierung und Aufreinigung auftreten können, ist Kollagen Typ I (C8919) eher ein heterogenes Gemisch als eine reine Verbindung. Diese Variabilität sowie geringfügige Unterschiede im Rohstoff führen dazu, dass sich die Opazität der Lösung von Charge zu Charge ändert. Produkte, die als steril aufgeführt sind, werden vor der Freigabe zum Verkauf an unsere Kunden auf Sterilität getestet. Eine weitere Filtration dieser Produkte ist nicht erforderlich. Ein milchiges oder partikelförmiges Aussehen ist kein Anzeichen für eine mikrobielle Verunreinigung und beeinträchtigt die Verwendung des Produkts nicht.

Warum sehe ich einige unlösliche Partikel in meiner Kollagenlösung?

Die Löslichkeitsspezifikation für einige Kollagenprodukte wie C7661 ist eine klare bis trübe farblose Lösung mit einigen unlöslichen Verbindungen bei 1 mg/ml in Wasser mit 2 μl Essigsäure (oder 0,1 N Essigsäure). Die unlöslichen Verbindungen können durch Absetzen oder Zentrifugieren entfernt werden.

Welches Lösungsmittel ist am besten für die Verdünnung von Kollagen geeignet?

Die die für die Verdünnung von Collagenen geeigneten Lösungsmittel sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Was ist die optimale Kollagenkonzentration für die Beschichtung?

Was ist die optimale Kollagenkonzentration für die Beschichtung?

Das Produkt gelierte im gekühlten Zustand. Kann es noch verwendet werden?

Dies kann vorkommen, schadet dem Produkt aber nicht. Bei Erwärmung auf Raumtemperatur wird das Produkt flüssig. Bitte stellen Sie sicher, dass es vor der Verdünnung zur Beschichtung von Kulturgefäßen gut gemischt wird.

Können alle Kollagenprodukte zur Herstellung von 3-D-Kollagengelen verwendet werden?

Die Kollagenprodukte, die zur Herstellung von Gelen verwendet werden können, sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Wie lange können kollagenbeschichtete Platten gelagert werden?

Wir geben keine Empfehlungen für die Lagerung der Platten nach der Beschichtung. Da verschiedene Faktoren, wie z. B. die Luftfeuchtigkeit, die Langlebigkeit der beschichteten Platten beeinflussen können, sollen Kunden selbst entscheiden, ob und unter welchen Bedingungen die Platten gelagert werden können. Das Produkt soll keinen Temperaturen über 50 °C ausgesetzt werden.