TRI Reagent^® Protokoll

Wozu dient TRI Reagent^®?

TRI Reagent^® Lösung (die auch unter dem Namen TRIzol vertrieben wird) ist eine Mischung aus Guanidiniumthiocyanat und Phenol in einer einphasigen Lösung, die zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus biologischen Proben von Menschen, Tieren, Pflanzen, Hefen, Bakterien und Viren verwendet wird. Sie hemmt die RNase-Aktivität. TRI Reagent^® wird eingesetzt, um die biologische Probe, aus der RNA, DNA oder Proteine extrahiert werden, zu homogenisieren.

Durchführung

Probenvorbereitung

1A. Gewebe:
Homogenisieren Sie die Gewebeproben in TRI Reagent (1 ml pro 50–100 mg Gewebe) in einem Polytron^® oder einem anderen geeigneten Homogenisator.

Hinweis: Wenn eine minimale Scherung der DNA gewünscht ist, verwenden Sie bitte einen locker sitzenden Homogenisator, keinen Polytron (siehe DNA-Isolierung, Schritt 3, Hinweis b). Das Volumen des Gewebes sollte 10 % des TRI Reagent-Volumens nicht überschreiten.

1B. Monolayer-Zellen:
Lysieren Sie die Zellen direkt in der Kulturschale. Verwenden Sie 1 ml TRI Reagent pro 10 cm² Glaskulturplattenoberfläche. Nach der Reagenszugabe sollte das Zelllysat mehrmals durch eine Pipette auf und ab gezogen werden, um ein homogenes Lysat zu erzeugen.

Hinweis: TRI Reagent ist nicht mit Kunststoff-Kulturplatten kompatibel.

1C. Suspensionszellen:
Isolieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren. Anschließend lysieren Sie diese in TRI Reagent durch wiederholtes Pipettieren. Ein ml TRI Reagent ist ausreichend, um 5–10 × 10⁶ Tier-, Pflanzen- oder Hefezellen oder 10⁷ Bakterienzellen zu lysieren.

Hinweis:

• Falls die Proben einen hohen Gehalt an Fett, Protein, Polysacchariden oder extrazellulärem Material enthalten, wie zum Beispiel Muskel- oder Fettgewebe oder Knollen von Pflanzen, kann ein zusätzlicher Schritt erforderlich sein. Nach der Homogenisierung zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 × g 10 Minuten lang bei 2–8 °C, um das unlösliche Material zu entfernen (extrazelluläre Membranen, Polysaccharide und DNA mit hoher Molekülmasse). Der Überstand enthält RNA und Proteine. Wenn die Probe einen hohen Fettgehalt hatte, befindet sich eine Schicht mit fetthaltigem Material auf der Oberfläche der wässrigen Phase, die entfernt werden sollte. Übertragen Sie den klaren Überstand dann in ein neues Röhrchen und fahren Sie mit Schritt 2 fort. Gewinnen Sie die DNA mit hoher Molekülmasse aus dem Pellet, indem Sie die Schritte 2 und 3 der DNA-Isolierung durchführen.
• Für manche Hefe- und Bakterienzellen ist möglicherweise ein Homogenisator erforderlich.
• Nachdem die Zellen in TRI Reagent homogenisiert oder lysiert worden sind, können die Proben bei –70 °C bis zu 1 Monat lang gelagert werden.

Phasentrennung: Lassen Sie die Proben 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um sicherzustellen, dass die Nukleoproteinkomplexe vollständig dissoziieren. Fügen Sie 0,1 ml 1‑Brom-3‑chlorpropan oder 0,2 ml Chloroform (siehe Phasentrennung, Hinweise a und b) pro ml eingesetztem TRI Reagent hinzu. Verschließen Sie das Probengefäß fest, schütteln Sie es 15 Sekunden lang kräftig und lassen Sie es 2–15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie das entstandene Gemisch bei 12.000 × g 15 Minuten lang bei 2–8 °C. Durch die Zentrifugation wird das Gemisch in 3 Phasen aufgetrennt: eine rote organische Phase (enthält Protein), eine Interphase (enthält DNA) und eine farblose obere wässrige Phase (enthält RNA).

Hinweis:

• 1-Brom-3-chlorpropan ist weniger toxisch als Chloroform. Durch seine Verwendung für die Phasentrennung wird das Risiko verringert, dass die RNA mit DNA kontaminiert wird.⁴
• Das für die Phasentrennung verwendete Chloroform sollte keinen Isoamylalkohol oder andere Zusatzstoffe enthalten.
• Zur Isolierung der Poly(A)⁺-Fraktion aus der wässrigen Phase siehe Anhang I.

RNA-Isolierung oder -Extraktion

1. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen und fügen Sie 0,5 ml 2-Propanol pro ml des bei Schritt 1 der Probenvorbereitung eingesetzten TRI Reagent-Volumens hinzu. Mischen Sie die Flüssigkeiten. Lassen Sie die Probe 5–10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 × g 10 Minuten lang bei 2–8 °C. Die RNA fällt als Pellet an der Seite und am Boden des Röhrchens aus.

Hinweis: Bewahren Sie die Interphase und die organische Phase bei 2–8 °C für die anschließende Isolierung der DNA und der Proteine auf.

2. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet durch Zugabe von mindestens 1 ml 75 % Ethanol pro 1 ml des bei Schritt 1 der Probenvorbereitung eingesetzten TRI Reagent-Volumens. Vortexen Sie die Probe und zentrifugieren sie dann bei 7.500 × g 5 Minuten lang bei 2–8 °C.

Hinweis:

• Falls die RNA-Pellets schwimmen, führen Sie den Waschschritt mit 75 % Ethanol bei 12.000 × g aus.
• Die Proben können in Ethanol mindestens 1 Woche lang bei 2–8 °C und bis zu 1 Jahr bei –20 °C gelagert werden.

3. Trocknen Sie das RNA-Pellet kurz 5–10 Minuten lang an der Luft oder im Vakuum. Lassen Sie das RNA-Pellet nicht vollständig trocknen, weil dadurch seine Löslichkeit deutlich geringer wird. Trocknen Sie das RNA-Pellet nicht durch Zentrifugation im Vakuum (Speed-Vac®). Geben Sie ein geeignetes Volumen an Formamid, Wasser oder einer 0,5%igen SDS-Lösung zu dem RNA-Pellet hinzu. Damit sich das Pellet besser auflöst, mischen Sie den Röhrcheninhalt durch wiederholtes Pipettieren mit einer Mikropipette bei 55–60 °C für 10–15 Minuten.

Hinweis:

• Das endgültige RNA-Präparat ist frei von DNA und Proteinen. Es sollte ein A260/A280-Verhältnis von ≥1,7 aufweisen.
• Die folgenden genannten Ausbeuten aus verschiedenen Gewebetypen (mg RNA/mg Gewebe) sind typisch: Leber, Milz: 6–10 mg; Niere: 3–4 mg; Skelettmuskel, Gehirn: 1–1,5 mg; Plazenta: 1–4 mg.
• Typische Ausbeuten aus kultivierten Zellen sind (mg RNA/106 Zellen): Epithelzellen: 8–15 mg; Fibroblasten: 5–7 mg.
• Durch Ethidiumbromidfärbung der RNA in Agarosegelen werden zwei dominante Banden von kleiner (2 kb) und großer (5 kb) ribosomaler RNA, RNA mit niedriger Molekülmasse (0,1–0,3 kb) und diskrete Banden von RNA mit hoher Molekülmasse (7–15 kb) sichtbar.

DNA-Isolierung oder -Extraktion

1. Nehmen Sie die verbliebene wässrige Phase über der Interphase vorsichtig ab und verwerfen Sie diese. Geben Sie 0,3 ml 100%iges Ethanol pro 1 ml des bei Schritt 1 der Probenvorbereitung eingesetzten TRI Reagent-Volumens hinzu, um die DNA aus der Interphase und der organischen Phase auszufällen. Mischen Sie die Probe durch Umdrehen des Röhrchens und lassen Sie sie 2–3 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.000 × g 5 Minuten lang bei 2–8 °C.

Hinweis: Die Entfernung der verbliebenen wässrigen Phase vor der Ausfällung der DNA ist ein entscheidender Schritt für die Qualität der isolierten DNA.

2. Nehmen Sie den Überstand ab und bewahren ihn bei 2–8 °C für die Proteinisolierung auf. Waschen Sie das DNA-Pellet zweimal in einer Lösung von 0,1 M Trinatriumcitrat in 10%igem Ethanol. Verwenden Sie 1 ml Waschlösung pro 1 ml des bei Schritt 1 der Probenvorbereitung eingesetzten TRI Reagent-Volumens. Lassen Sie das DNA-Pellet bei jedem Waschschritt mindestens 30 Minuten lang (unter gelegentlichem Mischen) stehen. Zentrifugieren Sie die DNA-Probe bei 2.000 × g 5 Minuten lang bei 2–8 °C. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 75%igem Ethanol (1,5–2 ml pro 1 ml TRI Reagent) und lassen Sie es 10–20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Hinweis:

• Wichtig: Verkürzen Sie die Zeitdauer nicht, die sich die Proben in der Waschlösung befinden. 30 Minuten ist die absolute Mindestzeitdauer, die notwendig ist, um das Phenol effizient von der DNA zu entfernen.
• Wenn das Pellet >200 mg DNA oder große Mengen an Nicht-DNA-Material enthält, ist ein zusätzlicher Waschschritt in der Lösung von 0,1 M Trinatriumcitrat in 10%igem Ethanol erforderlich.
• In 75%igem Ethanol suspendierte Proben können mehrere Monate lang bei 2–8 °C aufbewahrt werden.

3. Trocknen Sie das DNA-Pellet 5–10 Minuten lang im Vakuum und lösen Sie es anschließend in 8 mM NaOH durch wiederholtes langsames Pipettieren mit einer Mikropipette. Fügen Sie ausreichend 8 mM NaOH für eine DNA-Endkonzentration von 0,2–0,3 mg/ml hinzu (typischerweise 0,3–0,6 ml zu der isolierten DNA aus 50–70 mg Gewebe oder 107 Zellen). Durch diese mild alkalische Lösung wird sichergestellt, dass sich das DNA-Pellet vollständig auflöst. Zentrifugieren Sie die DNA-Probe bei 12.000 × g 10 Minuten lang, um das unlösliche Material zu entfernen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen.

Hinweis:

• Ein viskoser Überstand zeigt an, dass DNA mit hoher Molekülmasse vorhanden ist.
• Die Größe der DNA hängt von der bei der Homogenisierung ausgeübten Kraft ab. Verwenden Sie keinen Polytron-Homogenisator.
• In 8 mM NaOH gelöste Proben können über Nacht bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Für die Langzeitlagerung stellen Sie den pH-Wert auf zwischen 7 und 8 ein und ergänzen EDTA (Endkonzentration 1 mM).
• Zur Bestimmung der DNA-Konzentration entnehmen Sie ein Aliquot, verdünnen es mit Wasser und messen die A260. Bei doppelsträngiger DNA ist 1 A260 Einheit/ml = 50 µg/ml.
• Zur Berechnung der Zellzahl wird der DNA-Gehalt von 106 diploiden Zellen von Menschen, Ratten und Mäusen mit 7,1 µg, 6,5 µg bzw. 5,8 µg angenommen.
• Die folgenden genannten Ausbeuten aus verschiedenen Gewebetypen (µg DNA/mg Gewebe) sind typisch: Leber, Niere: 3–4 µg; Skelettmuskel, Gehirn und Plazenta: 2–3 µg.
• Typische Ausbeuten aus kultivierten Zellen von Menschen, Ratten und Mäusen sind: 5–7 µg DNA/106 Zellen.

Amplifikation von DNA durch PCR

Nach Auflösen des DNA-Pellets in 8 mM NaOH stellen Sie den pH-Wert mit HEPES auf 8,4 ein (geben Sie 86 µl 0,1 M HEPES, freie Säure/ml DNA-Lösung dazu). Fügen Sie die DNA-Probe (im Allgemeinen 0,1–1 µg) zu der PCR-Mischung hinzu und gehen Sie nach dem PCR-Protokoll vor.

DNA-Verdau mit Restriktionsenzymen

Stellen Sie den pH-Wert der DNA-Lösung auf den pH-Wert ein, der für den Restriktionsenzymverdau benötigt wird. Verwenden Sie hierfür HEPES oder dialysieren Sie die Proben gegen 1 mM EDTA, pH 7–8. Inkubieren Sie den Restriktionsenzymverdau 3–24 Stunden lang unter optimalen Bedingungen. Es wird empfohlen, 3–5 Enzymeinheiten pro 1 µg DNA zu einzusetzen. Typischerweise werden 80–90 % der DNA verdaut.

Proteinisolierung

1. Fällen Sie die Proteine (siehe Hinweis) in dem Phenol-Ethanol-Überstand (DNA-Isolierung, Schritt 2) mit 1,5 ml 2-Propanol pro 1 ml des bei Schritt 1 der Probenvorbereitung eingesetzten TRI Reagent-Volumens aus. Lassen Sie die Proben mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 × g 10 Minuten lang bei 2–8 °C.

Hinweis: Bei manchen Proben löst sich das Protein-Pellet möglicherweise schlecht in 1%igem SDS (Schritt 3). Verwenden Sie diese alternative Vorgehensweise, um das Problem zu beheben:

• Dialysieren Sie den Phenol-Ethanol-Überstand gegen dreimal ausgetauschtes 0,1%iges SDS bei 2–8 °C.
• Zentrifugieren Sie das Dialysat bei 10.000 × g 10 Minuten lang bei 2–8 °C.
• Der klare Überstand enthält Protein, das für die Verwendung in Western-Blotting-Verfahren geeignet ist.

2. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet dreimal in 0,3 M Guanidinhydrochloridlösung in 95%igem Ethanol mit jeweils 2 ml pro 1 ml des bei Schritt 1 der Probenvorbereitung eingesetzten TRI Reagent-Volumens. Lassen Sie die Waschlösung bei jedem Waschschritt 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in den Proben einwirken. Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 × g 5 Minuten lang bei 2–8 °C. Nach den 3 Waschschritten geben Sie 2 ml 100%iges Ethanol dazu und vortexen das Proteinpellet. Lassen Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 × g 5 Minuten lang bei 2–8 °C.

Hinweis: Proteinproben, die in 0,3 M Guanidinhydrochloridlösung in 95%igem Ethanol oder in 100%igem Ethanol suspendiert sind, können 1 Monat bei 2–8 °C oder 1 Jahr bei –20 °C gelagert werden.

3. Trocknen Sie das Proteinpellet 5–10 Minuten lang im Vakuum. Lösen Sie das Pellet in 1%igem SDS, indem Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Proteinprobe bei 10.000 × g 10 Minuten lang bei 2–8 °C, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen. Die Proteinlösung sollte sofort für Western Blotting verwendet werden oder bei –20 °C gelagert werden.

Leitfaden für die Fehlerbehebung

1. RNA-Isolierung:

A. Wenn die Ausbeute gering ist,

• wurden die Proben möglicherweise nicht vollständig homogenisiert oder lysiert;
• wurde das endgültige RNA-Pellet möglicherweise nicht vollständig gelöst.

B. Wenn das A260/A280-Verhältnis < 1,65 beträgt,

• wurde möglicherweise eine zu geringe Probenmenge homogenisiert;
• wurden die Proben möglicherweise nach der Homogenisierung nicht 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen;
• wurde die wässrige Phase möglicherweise mit der Phenolphase kontaminiert;
• wurde das endgültige RNA-Pellet möglicherweise nicht vollständig gelöst.

C. Wenn die RNA abgebaut worden ist,

• wurden die Gewebeproben möglicherweise nach der Entnahme aus dem Tier nicht sofort verarbeitet oder eingefroren;
• wurden die für die Isolierung verwendeten Proben oder die Präparate mit der isolierten RNA möglicherweise bei –20 °C und nicht wie in der Anleitung angegeben bei –70 °C gelagert;
• wurden die Zellen möglicherweise durch Trypsinverdau dispergiert;
• wurden wässrige Lösungen oder Röhrchen für das Verfahren verwendet, die möglicherweise nicht RNAse-frei waren;
• hatte das für die Agarose-Gelelektrophorese verwendete Formaldehyd einen pH-Wert von <3,5.

D. Wenn eine Kontamination mit DNA vorliegt,

• wurde möglicherweise ein zu kleines Reagensvolumen für die Homogenisierung der Probe verwendet;
• enthielten die für die Isolierung verwendeten Proben möglicherweise organische Lösungsmittel (Ethanol, DMSO), starke Puffer oder alkalische Lösung.

2. DNA-Isolierung:

A. Wenn die Ausbeute gering ist,

• wurden die Proben möglicherweise nicht vollständig homogenisiert oder lysiert;
• wurde das endgültige DNA-Pellet möglicherweise nicht vollständig gelöst.

B. Wenn das A260/A280-Verhältnis < 1,70 beträgt,

• wurde das Phenol möglicherweise nicht ausreichend aus dem DNA-Präparat entfernt. Waschen Sie das DNA-Pellet noch einmal mit der Lösung von 0,1 M Trinatriumcitrat in 10%igem Ethanol.

C. Wenn die DNA abgebaut worden ist,

• wurden die Gewebeproben möglicherweise nach der Entnahme aus dem Tier nicht sofort verarbeitet oder eingefroren;
• wurden die für die Isolierung verwendeten Proben möglicherweise bei –20 °C und nicht wie in der Anleitung angegeben bei –70 °C gelagert;
• wurden die Proben möglicherweise mit einem Polytron oder einem anderen Hochgeschwindigkeitshomogenisator homogenisiert.

D. Wenn eine Kontamination mit RNA vorliegt,

• ist möglicherweise zu viel wässrige Phase in der organischen Phase und der Interphase verblieben;
• wurde das DNA-Pellet möglicherweise nicht ausreichend mit der Lösung von 0,1 M Trinatriumcitrat in 10%igem Ethanol gewaschen.

3. Proteinisolierung:

A. Wenn die Ausbeute gering ist,

• wurden die Proben möglicherweise nicht vollständig homogenisiert oder lysiert;
• wurde das endgültige Proteinpellet möglicherweise nicht vollständig gelöst.

B. Wenn das Protein abgebaut worden ist,

• wurden die Gewebeproben möglicherweise nach der Entnahme aus dem Tier nicht sofort verarbeitet oder eingefroren;

C. Wenn bei der PAGE deformierte Banden auftreten:

• wurde das Proteinpellet möglicherweise nicht ausreichend gewaschen.

Anhang

I. Isolierung von Poly(A)+ RNA
Nachdem die RNA mit 2-Propanol ausgefällt worden ist (RNA-Isolierung, Schritt 1), lösen Sie das Pellet in Poly(A)+ Bindungspuffer und lassen es durch eine Oligo(dT)-Cellulosesäule laufen, um die mRNA nach dem Verfahren von Aviv und Leder selektiv zu entfernen.³

II. Die isolierte RNA soll für RT-PCReingesetzt werden

1. Wird das Verfahren modifiziert und der zusätzliche Zentrifugationsschritt von Schritt 1B, Hinweis C bei der anfänglichen Probenvorbereitung durchgeführt, wird das Risiko einer DNA-Kontamination der mit TRI Reagent LS extrahierten RNA weiter verringert.

2. Wenn die RNA-Proben für RT-PCR verwendet werden sollen, muss das Ethanol vollständiger verdampft werden. Dies ist insbesondere bei Proben mit kleinen Volumina (5–20 μl) wichtig, da diese einen relativ hohen Ethanolgehalt haben können, wenn sie nicht ausreichend getrocknet werden.

Literatur

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156–159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408–1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163–164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126