Ficoll^® 400 für die Gradientenzentrifugation

Produkt-Nr. F4375

CAS #: 26873-85-8

Ficoll^® 400 ist ein hochverzweigtes Polymer, das durch die Copolymerisation von Saccharose und Epichlorhydrin gebildet wird. Ficoll^®-400 ist vollständig nicht-ionisch. Aufgrund der großen Anzahl an Hydroxylgruppen ist Ficol^®-400 sehr hydrophil und extrem wasserlöslich. Der häufigste Einsatzbereich für Ficoll^®-400 liegt in der Verwendung als Dichtegradientenmedium für die Abtrennung und Isolierung eukaryotischer Zellen, Organellen und Bakterienzellen. Es können Dichtebereiche bis zu 1,2 g/ml erzielt werden. Es wurde auch in zahlreichen anderen Anwendungen eingesetzt.

Physikalische Eigenschaften

Aussehen: Weißes Pulver bis weißes Pulver mit leichtem Gelbstich

Trocknungsverlust: Nicht mehr als 5 %¹

Molekulargewicht: 400.000 +/- 100.000 wie durch Grenzviskosität bestimmt¹

Spezifische Rotation: +56,5° bei 20 °C (C=1 % in Wasser)¹                                        

Intrinsische Viskosität: etwa 0,17 dl/g¹

Dialysierbares Material einschließlich NaCl: weniger als 1 %¹

Stokes-Radius: etwa 10 nm¹

Im Gegensatz zu Saccharose haben Ficoll-Lösungen eine relativ geringe Osmolalität. Trotzdem ist die Dichte von Ficoll in wässrigen Lösungen mit der von Saccharose vergleichbar.

Aufgrund des höheren Molekulargewichts und der geringen dialysierbaren Anteile weist Ficoll eine weitaus geringere Durchlässigkeit für Zellmembranen auf als Saccharose. Daher ist zu erwarten, dass sich Zellen bei einer geringeren Dichte in Ficoll-Gradienten ansammeln als in Saccharose-Gradienten. Aufgrund der geringen Membrandurchlässigkeit und des geringen osmotischen Drucks bleiben Zellfunktion und -morphologie bei Trennungen in Ficoll normalerweise besser erhalten.

Lagerung / Haltbarkeit

Bei ordnungsgemäßer Lagerung als Pulver bei Raumtemperatur ist Ficoll 400 etwa 5 Jahre haltbar.

Löslichkeit / Haltbarkeit der Lösung

Es können Konzentrationen bis zu 50 % (w/v) in Wasser erzielt werden. Ficoll soll langsam unter ständigem Rühren zugegeben werden.

Wir testen die Löslichkeit von Ficoll 400 bei 1 g in 10 ml entionisiertem Wasser, woraus eine klare bis leicht trübe, farblose bis leicht gelbe Lösung resultiert. 

Ficoll ist in alkalischen und neutralen Lösungen stabil. Bei pH-Werten unter 3 wird es schnell hydrolysiert, insbesondere bei höheren Temperaturen. 

Ficoll kann durch 30-minütiges Autoklavieren bei 110 °C und bei neutralem pH-Wert autoklaviert werden. 

Starke Oxidations- und Reduktionsmittel sind zu vermeiden.

Durchführung

Zentrifugation

Ficoll^® 400 kann für die Gradientenzentrifugation in allen Arten von Zentrifugenrotoren und für die Schwerkrafttrennung von Zellen/Partikeln eingesetzt werden. Bei der Zentrifugation sind sowohl diskontinuierliche als auch kontinuierliche Gradienten möglich. Diskontinuierliche Gradienten bieten zwei wesentliche Vorteile: Erstens bedeuten die abrupten Änderungen der Ficoll-400-Dichte, dass isolierte Zellen in scharfen Banden an der Grenzfläche zwischen Schichten unterschiedlicher Dichte zu finden sind. Dies ermöglicht eine einfache Entnahme der Probe mit einer Pipette. Zweitens können Zellen mit großen Dichteunterschieden leicht mit nur zwei Dichteschichten isoliert werden. Dies wird durch die Auswahl von Dichten erreicht, die einen oder mehrere Zelltypen daran hindern, in die untere Phase einzudringen, sodass diese Zelltypen an der Grenzfläche gebündelt werden.

Um die für eine bestimmte Anwendung erforderliche Dichte abzuschätzen, kann die nachstehende Tabelle herangezogen werden:

Quelle	Schwebedichte	Bedingungen
Membranen	1,05	100.000xg für 16 h
Chromatophoren	1,07	195.000xg für 36 h
Hepatozyten	1,10-1,15	6.000xg für 2 h
Fibroblasten	1,05	8.000xg für 1 h
Ehrlich-Aszites-Zellen	1,07	1.400xg für 45 min

Abbildung 1. Es folgt das Dichtediagramm von Ficoll als eine Funktion der Konzentration.

Vorbereiten eines diskontinuierlichen Gradienten:

1. Ficoll 400 in Puffer oder isotonischer Saccharoselösung (0,25 M) in Konzentrationen vorbereiten, die das gewünschte Material abtrennen sollten. Die meisten Zellen und Organellen haben in Ficoll 400 eine Schwebedichte zwischen 1,0 und 1,2 g/ml.  Oft reicht ein zweischichtiger Gradient aus. Die in diesem Schritt hergestellten Lösungen können im Kühlschrank aufbewahrt werden, sollen aber bei Raumtemperatur verwendet werden.
   
2. In handelsüblichen Zentrifugenröhrchen werden ca. 1 cm dicke Schichten gebildet, wobei sich die dichteste Schicht am Boden befindet.
   
3. Darauf achten, die Gradientenschichten nicht zu vermischen und die Probe vorsichtig darüberlegen. Die Probe und die oberste Ficoll-400-Schicht vorsichtig mit einem Glasstab umrühren, um die Grenzfläche vor der Zentrifugation zu beseitigen.

Während der Zentrifugation sammeln sich die verschiedenen Partikel abhängig von ihrer Dichte entweder in oder zwischen den Ficoll-Schichten. Nach Beendigung der Zentrifugation die verschiedenen Phasen abpipettieren und das Ficoll von den Zielfraktionen entfernen. Ficoll kann durch wiederholte Verdünnung mit Puffer und anschließender Zentrifugation aus isolierten Zellen und Organellen entfernt werden. Restmengen von Ficoll 400 in der Probe können mit der Anthronreaktion geschätzt werden.²

In manchen Fällen kann ein kontinuierlicher oder linearer Dichtegradient erwünscht sein. Dieser kann leicht mit einem Gradientenmischer erstellt werden. Für einfache Trennungen kann eine homologe Ficoll-400-Lösung ohne Gradient verwendet werden.  Die Fraktionierung wird durch schrittweise Erhöhung der Zentrifugationsgeschwindigkeit erreicht. Ficoll wurde auch in zonalen Zentrifugationsstudien eingesetzt.³

Die Schwerkraftsedimentation durch einen Dichtegradienten wird häufig verwendet, um Zellen zu trennen, die empfindlich auf Zentrifugation reagieren. Auch Zellen mit ähnlicher Dichte aber unterschiedlicher Größe können bei gleicher Schwerkraft effizient getrennt werden.^4,5,6

Ficoll-Hypaque-Dichtemedien (Histopaque)

Bei Anwendungen, die Ficoll-Hypaque erfordern, wird eine Mischung aus Ficoll und Natriumdiatrizoat verwendet. Wir bieten vorgefertigte Gemische in drei verschiedenen Dichten unter den Produktnamen Histopaque-1077, 1083 und 1119 an.

Nukleinsäurehybridisierung

Ficoll 400 ist ein Bestandteil der Denhardt-Lösung, die in der Northern- und Southern-Blot-Analyse verwendet wird. Ficoll reduziert die unspezifische Bindung von Material an Nitrocellulosemembranen während der Nukleinsäurehybridisierung.⁷

Wir bieten eine Denhardt-Lösung (Produkt-Nr. D2532), 50X-Konzentrat, getestet für die Verwendung bei der Nukleinsäurehybridisierung an. Typische Hybridisierungslösungen erfordern eine 5X-Konzentration der Denhardt-Lösung.

Immunologische Anwendungen

Ficoll 400 wird als Hapten-Träger eingesetzt und mit Dinitrophenol, Trinitrophenol und Fluoresceinisothiocyanat konjugiert, um die primäre Immunantwort in Mäusen zu verstärken. Konjugate mit einer Reihe von Substitutionsgraden und minimaler Toxizität lassen sich leicht vorbereiten.^8,9

Chemisch definierte Zellkulturmedien

Ficoll wird mit und ohne Serum-abgeleitete Wachstumsfaktoren verwendet, um das Wachstum von Primärkulturen und etablierten Zelllinien zu unterstützen.^10,11

Dialyse von Konzentrationen

Ficoll 400 eignet sich für die Konzentrierung von Lösungen durch Dialyse, da es aufgrund seines hohen Molekulargewichts die Dialysemembran nicht passieren kann. Der osmotische Druck zieht Wasser durch die Membran in die Lösung von Ficoll 400, wodurch empfindliche Materialien effektiv konzentriert werden.¹

Elektrophorese

Bei der Continuous-Flow-Elektrophorese ist in der Regel ein Stabilisator im Elektrolyten erforderlich. Ficoll 400 wird häufig für diese Anwendung eingesetzt.^12,13

Phasenseparation

Bei der Phasenseparation werden die Zellen auf Grundlage ihrer Oberflächeneigenschaften getrennt. Ficoll 400 wird in Zweiphasensystemen mit Polyethylenglykol und in Dreiphasensystemen mit Dextran und Polyethylenglykol kombiniert.^14,15

Lösungen für physiologische Perfusion und Zellstabilisierung

Ficoll wurde dem Perfusat der physiologischen Kochsalzlösung bei der Überwachung der Proteinausscheidung in Gefäßen zugesetzt. Vitrifizierte Mausembryonen wurden mit Lösungen verdünnt, die 30 % Ficoll und 0,5 M Saccharose enthielten.¹⁷ Isolierte Rattennieren wurden mit Tyrode-Lösung perfundiert, die 4,7 % Ficoll 400 enthielt.¹⁸

*Ficoll ist eine eingetragene Marke von Pharmacia. Informationen über physikalische Eigenschaften und Anwendungen wurden von Pharmacia bezogen.

Zugehörige Produkte

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Literatur

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