17-10234
LentiBrite-GFP-Rad51-Biosensor, lentiviral
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About This Item
UNSPSC-Code:
12352207
eCl@ss:
34360190
NACRES:
NA.32
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Allgemeine Beschreibung
Lesen Sie unseren Anwendungshinweis in Nature Methods!
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
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Erfahren Sie mehr über die Vorteile unserer LentiBrite lentiviralen Biosensoren! Hier klicken
Biosensoren können zum Nachweis des Vorliegens/Fehlens eines bestimmten Proteins sowie des subzellulären Orts dieses Proteins im lebenden Zustand einer Zelle eingesetzt werden. Fluoreszenzmarkierungen sind oft das gewünschte Mittel zum Veranschaulichen des Proteins von Interesse in einer Zelle mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Zeitraffer-Videoaufnahme. Das Veranschaulichen von lebenden Zellen ohne Störung ermöglicht es Forschenden die zellulären Bedingungen in Echtzeit zu sehen.
Lentivirale Vektorsysteme sind ein beliebtes Forschungswerkzeug zum Einbringen von Genprodukten in Zellen. Die lentivirale Transfektion bietet Vorteile gegenüber nichtviralen Verfahren wie einer Transfektion auf chemischer Basis, einschließlich die Transfektion von teilungsfähigen und nicht teilungsfähigen Zellen mit höherer Effizienz, der stabilen Langzeitexpression des Transgens und der geringen Immunogenität.
EMD Millipore stellt lentivirale LentiBrite-Biosensoren vor, eine neue Serie vorgepackter lentiviraler Partikel, die wichtige und grundlegende Proteine für Autophagie, Apoptose und Zellstruktur zur Veranschaulichung unter verschiedenen Zell-/Erkrankungszuständen in lebenden Zellen und in der In-vitro-Analyse kodieren.
Lentivirale LentiBrite GFP-Rad51-Partikel von EMD Millipore bieten eine strahlende Fluoreszenz und präzise Lokalisierung, um die Lebendzellanalyse der Rad51-Translokation von schwer zu transfizierenden Zelltypen zu ermöglichen.
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
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Biosensoren können zum Nachweis des Vorliegens/Fehlens eines bestimmten Proteins sowie des subzellulären Orts dieses Proteins im lebenden Zustand einer Zelle eingesetzt werden. Fluoreszenzmarkierungen sind oft das gewünschte Mittel zum Veranschaulichen des Proteins von Interesse in einer Zelle mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Zeitraffer-Videoaufnahme. Das Veranschaulichen von lebenden Zellen ohne Störung ermöglicht es Forschenden die zellulären Bedingungen in Echtzeit zu sehen.
Lentivirale Vektorsysteme sind ein beliebtes Forschungswerkzeug zum Einbringen von Genprodukten in Zellen. Die lentivirale Transfektion bietet Vorteile gegenüber nichtviralen Verfahren wie einer Transfektion auf chemischer Basis, einschließlich die Transfektion von teilungsfähigen und nicht teilungsfähigen Zellen mit höherer Effizienz, der stabilen Langzeitexpression des Transgens und der geringen Immunogenität.
EMD Millipore stellt lentivirale LentiBrite-Biosensoren vor, eine neue Serie vorgepackter lentiviraler Partikel, die wichtige und grundlegende Proteine für Autophagie, Apoptose und Zellstruktur zur Veranschaulichung unter verschiedenen Zell-/Erkrankungszuständen in lebenden Zellen und in der In-vitro-Analyse kodieren.
- Vorgepackt, mit GFP & RFP fluoreszenzmarkiert
- Transfektion mit höherer Effizienz im Vergleich zu traditionellen Transfektionen auf chemischer Basis und anderen Transfektionsverfahren auf nicht-viraler Basis
- Fähigkeit zum Transfizieren von teilungsfähigen und nicht-teilungsfähigen Zellen sowie schwer zu transfizierenden Zelltypen wie Primärzellen und Stammzellen
- Stört die Zellfunktion nicht
Lentivirale LentiBrite GFP-Rad51-Partikel von EMD Millipore bieten eine strahlende Fluoreszenz und präzise Lokalisierung, um die Lebendzellanalyse der Rad51-Translokation von schwer zu transfizierenden Zelltypen zu ermöglichen.
Rad51 ist eine eukaryotische RecA-ähnliche Rekombinase und spielt eine Schlüsselrolle bei der homologen Rekombination, die sowohl im normalen Zellzyklus als auch bei der Reparatur von DNA-Schäden auftritt. Überschüssiges zelluläres Rad51, das bei vielen Krebserkrankungen auftritt, führt jedoch zu Resistenz gegenüber DNA-schädigender Bestrahlung und Chemotherapie sowie genomischer Instabilität. Nach einer DNA-Schädigung, die zu Doppelstrangbrüchen führt, koalesziert Rad51 aus dem Nukleoplasma zu diskreten nuklearen Foci, die aber auch ohne DNA-Schädigung auftreten, wenn Rad51 überexprimiert wird. Die Rad51-Expression fusioniert mit GFP wurde genutzt, um die Dynamik der Rad51-Aufteilung in lebenden Zellen nachzuverfolgen.
Lentivirale LentiBrite-GFP-Rad51-Partikel von EMD Millipore bieten eine strahlende Fluoreszenz und präzise Lokalisierung, um die Lebendzellanalyse der Rad51-Translokation von schwer zu transfizierenden Zelltypen zu ermöglichen.
Lentivirale LentiBrite-GFP-Rad51-Partikel von EMD Millipore bieten eine strahlende Fluoreszenz und präzise Lokalisierung, um die Lebendzellanalyse der Rad51-Translokation von schwer zu transfizierenden Zelltypen zu ermöglichen.
Anwendung
Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung:
HeLa-Zellen wurden auf einem Kammerobjektträger ausplattiert und mit lentiviralen Partikeln mit einer MOI von 20 für 24 Stunden transduziert. Nach einem Medienaustausch und einer weiteren Inkubation für 48 Stunden wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und eingedeckt. Die Bilder wurden durch Ölimmersion-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie erhalten. GFP-Rad51 zeigt eine variable punktuelle Verteilung im Zellkern und wird wohl von den Nukleoli ausgeschlossen.
Immunzytohistochemischer Vergleich:
U2OS-Zellen wurden auf einem Kammerobjektträger ausplattiert und mit lentiviralen Partikeln mit einer MOI von 5 für 24 Stunden transduziert. Nach 24 Stunden wurde das Medium ausgetauscht und die Zellen wurden für weitere 48 Stunden inkubiert. Die immunzytochemische Färbung (rot) desselben Sichtfelds mit einem polyklonalen Antikörper gegen Rad51 (Art.-Nr. ABE257) zeigt ähnliche Expressionsmuster wie GFP-Rad51 (grün).
Schwer zu transfizierende Zelltypen:
Die primären Zelltypen HUVEC oder HuMSC wurden auf Kammerobjektträgern ausplattiert und mit lentiviralen Partikeln mit einer MOI von 20 bzw. 5 für 24 Stunden transduziert.
Konfokale Mikroskopiebildgebung:
U2OS-Zellen wurden mit GFP-Rad51 transduziert. Die Zellen wurden gegengefärbt mit TRITC-Phalloidin, um die Aktin-Filamente (rot) zu zeigen, sowie mit DAPI, um den Zellkern (blau) darzustellen. Die Bilder wurden durch Ölimmersion-Konfokalfluoreszenzmikroskopie gewonnen.
Zusätzlicher Zelltyp:
HT1080-Zellen wurden behandelt.
Für eine optimale fluoreszente Veranschaulichung wird empfohlen, die Zielexpressionswerte innerhalb von 24-48 Stunden nach der Transfektion/Infektion zu analysieren, um eine optimale Lebendzellanalyse zu erhalten, da die Fluoreszenzintensität mit der Zeit schwächer werden kann, insbesondere in schwer zu transfizierenden Zelllinien. Infizierte Zellen können nach einer erfolgreichen Transfektion/Infektion eingefroren und in Kultur aufgetaut werden, um die positive Fluoreszenzexpression länger als 24–48 Stunden zu erhalten. Die Länge und Intensität der Fluoreszenzexpression variiert zwischen den Zelllinien. Für schwer zu transfizierende Zelllinien können höhere MOI erforderlich sein.
HeLa-Zellen wurden auf einem Kammerobjektträger ausplattiert und mit lentiviralen Partikeln mit einer MOI von 20 für 24 Stunden transduziert. Nach einem Medienaustausch und einer weiteren Inkubation für 48 Stunden wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und eingedeckt. Die Bilder wurden durch Ölimmersion-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie erhalten. GFP-Rad51 zeigt eine variable punktuelle Verteilung im Zellkern und wird wohl von den Nukleoli ausgeschlossen.
Immunzytohistochemischer Vergleich:
U2OS-Zellen wurden auf einem Kammerobjektträger ausplattiert und mit lentiviralen Partikeln mit einer MOI von 5 für 24 Stunden transduziert. Nach 24 Stunden wurde das Medium ausgetauscht und die Zellen wurden für weitere 48 Stunden inkubiert. Die immunzytochemische Färbung (rot) desselben Sichtfelds mit einem polyklonalen Antikörper gegen Rad51 (Art.-Nr. ABE257) zeigt ähnliche Expressionsmuster wie GFP-Rad51 (grün).
Schwer zu transfizierende Zelltypen:
Die primären Zelltypen HUVEC oder HuMSC wurden auf Kammerobjektträgern ausplattiert und mit lentiviralen Partikeln mit einer MOI von 20 bzw. 5 für 24 Stunden transduziert.
Konfokale Mikroskopiebildgebung:
U2OS-Zellen wurden mit GFP-Rad51 transduziert. Die Zellen wurden gegengefärbt mit TRITC-Phalloidin, um die Aktin-Filamente (rot) zu zeigen, sowie mit DAPI, um den Zellkern (blau) darzustellen. Die Bilder wurden durch Ölimmersion-Konfokalfluoreszenzmikroskopie gewonnen.
Zusätzlicher Zelltyp:
HT1080-Zellen wurden behandelt.
Für eine optimale fluoreszente Veranschaulichung wird empfohlen, die Zielexpressionswerte innerhalb von 24-48 Stunden nach der Transfektion/Infektion zu analysieren, um eine optimale Lebendzellanalyse zu erhalten, da die Fluoreszenzintensität mit der Zeit schwächer werden kann, insbesondere in schwer zu transfizierenden Zelllinien. Infizierte Zellen können nach einer erfolgreichen Transfektion/Infektion eingefroren und in Kultur aufgetaut werden, um die positive Fluoreszenzexpression länger als 24–48 Stunden zu erhalten. Die Länge und Intensität der Fluoreszenzexpression variiert zwischen den Zelllinien. Für schwer zu transfizierende Zelllinien können höhere MOI erforderlich sein.
Forschungskategorie
Apoptose & Krebs
Apoptose & Krebs
Forschungsunterkategorie
Zellzyklus, DNA-Replikation & -Reparatur
Zellzyklus, DNA-Replikation & -Reparatur
Komponenten
TagGFP2-Rad51-Lentivirus:
Ein Fläschchen mit 25 µl lentiviralen Partikeln mit mindestens 3 x 10E8 infektiösen Einheiten je ml. Chargenspezifische Titer-Informationen finden Sie im Datenblatt unter “Virentiter”.
Promotor
EF-1 (Elongation Factor-1)
Multiplizität der Infektion (MOI)
MOI = Verhältnis der Anzahl infektiöser lentiviraler Partikel (IFU) zur Anzahl infizierter Zellen.
Typische MOI-Werte für eine hohe Transduktionseffizienz und Signalintensität liegen im Bereich von 20-40. Für dieses Ziel können einige Zelltypen geringere MOI erfordern (z. B. HT-1080, HeLa, U2OS, humane mesenchymale Stammzellen (HuMSC)), während andere höhere MOI erfordern können (z. B. endotheliale Zellen der humanen Nabelschnur (HUVEC)).
HINWEIS: Die MOI sollte vom Anwender für jeden Zelltyp und jedes lentivirale Ziel titriert und optimiert werden, um die gewünschte Transduktionseffizienz und Signalintensität zu erreichen.
Ein Fläschchen mit 25 µl lentiviralen Partikeln mit mindestens 3 x 10E8 infektiösen Einheiten je ml. Chargenspezifische Titer-Informationen finden Sie im Datenblatt unter “Virentiter”.
Promotor
EF-1 (Elongation Factor-1)
Multiplizität der Infektion (MOI)
MOI = Verhältnis der Anzahl infektiöser lentiviraler Partikel (IFU) zur Anzahl infizierter Zellen.
Typische MOI-Werte für eine hohe Transduktionseffizienz und Signalintensität liegen im Bereich von 20-40. Für dieses Ziel können einige Zelltypen geringere MOI erfordern (z. B. HT-1080, HeLa, U2OS, humane mesenchymale Stammzellen (HuMSC)), während andere höhere MOI erfordern können (z. B. endotheliale Zellen der humanen Nabelschnur (HUVEC)).
HINWEIS: Die MOI sollte vom Anwender für jeden Zelltyp und jedes lentivirale Ziel titriert und optimiert werden, um die gewünschte Transduktionseffizienz und Signalintensität zu erreichen.
Qualität
Mittels Transduktion von HT-1080-Zellen beurteilt und für die Beurteilung der Transduktionseffizienz wurde eine Fluoreszenzbildgebung durchgeführt.
Physikalische Form
PEG-Fällung
Lagerung und Haltbarkeit
Lagerung und Handhabung
Lentivirus ist ab Empfangsdatum mindestens 4 Monate haltbar, wenn es bei -80 °C gelagert wird. Nach dem ersten Auftauen sofort auf Eis geben und in Arbeitsaliquoten bei -80 °C einfrieren. Gefrorene Aliquote können mindestens 2 Monate gelagert werden. Weiteres Einfrieren/Auftauen kann zu einem verringerten Virustiter und einer geringeren Transduktionseffizienz führen.
WICHTIGER SICHERHEITSHINWEIS
Replikationsdefiziente lentivirale Vektoren wie der in diesem Produkt gelieferte Vektor der 3. Generation verursachen bei Mensch oder Tier bekanntermaßen keine Erkrankungen. Lentiviren können jedoch in das Genom der Wirtszelle eindringen und bergen somit ein gewisses Risiko für Insertionsmutagenesen. Das Material gehört zur Risikogruppe 2 und die Handhabung sollte unter BSL2-Kontrollen erfolgen. Eine detaillierte Erörterung der Biosicherheit von lentiviralen Vektoren finden Sie in Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Lentivirus ist ab Empfangsdatum mindestens 4 Monate haltbar, wenn es bei -80 °C gelagert wird. Nach dem ersten Auftauen sofort auf Eis geben und in Arbeitsaliquoten bei -80 °C einfrieren. Gefrorene Aliquote können mindestens 2 Monate gelagert werden. Weiteres Einfrieren/Auftauen kann zu einem verringerten Virustiter und einer geringeren Transduktionseffizienz führen.
WICHTIGER SICHERHEITSHINWEIS
Replikationsdefiziente lentivirale Vektoren wie der in diesem Produkt gelieferte Vektor der 3. Generation verursachen bei Mensch oder Tier bekanntermaßen keine Erkrankungen. Lentiviren können jedoch in das Genom der Wirtszelle eindringen und bergen somit ein gewisses Risiko für Insertionsmutagenesen. Das Material gehört zur Risikogruppe 2 und die Handhabung sollte unter BSL2-Kontrollen erfolgen. Eine detaillierte Erörterung der Biosicherheit von lentiviralen Vektoren finden Sie in Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.
Rechtliche Hinweise
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Lagerklassenschlüssel
10 - Combustible liquids
WGK
WGK 2
Analysenzertifikate (COA)
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Fluorescent lentiviral particles encoding important GFP/RFP fusion proteins related to autophagy, apoptosis, and cell structure that enables live cell imaging.
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