這項研究的目標是建立一種檢測水中低濃度的內分泌干擾物雙酚A(BPA)的技術，更具體地說，是為了記錄配備Biopak®超濾器的Milli-Q® IQ 7000淨水系統(推薦用於分子生物學應用的配置)如何產生適用於BPA敏感胚胎學研究的參考超純水。
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內分泌干擾物如雙酚A帶來的健康問題
環境賀爾蒙是干擾人類和動物內分泌系統的化學物質。它們影響生長、生殖、免疫和神經系統，造成不良的健康後果。內分泌干擾物存在於塑膠（包括實驗室耗材與設備）、油漆、樹脂和表面活性劑中，可說是無所不在。
相關規範和標準規定了食品與飲料中允許的環境賀爾蒙最大含量及其在環境中的存在情況。在工業產生的各種環境賀爾蒙中， BPA 是最普遍的一種。BPA 被稱為“異雌激素”，因為它與雌激素相似，因此會引起重大的健康問題。多項研究已經證實，BPA 會干擾荷爾蒙的產生及其基因的表達。最新研究表明，即使是微量的 BPA（每日20 µg/kg，代表胎兒一星期內暴露於環境 BPA 的量）也會因為干擾卵母細胞在卵巢內的生長發育，而影響健康卵母細胞的生成（圖 1）。1-3
下述研究旨在證明 Milli-Q® 純水系統生產的超純（Type 1）水的品質，適合製備保證不含 BPA 的培養基和溶液，特別是生殖生物學實驗所需的不含 BPA 培養環境。
- 研究 1 顯示了使用高性能固相微萃取與氣相層析-質譜 (HP-SPME-GC-MS) 對不同類型的水進行 BPA 分析的結果。
- 研究 2 為細胞學和分子分析的結果，以評估 BPA 對卵母細胞成熟的影響。
- 研究 3 顯示了水對於細胞成像技術中使用的培養基的重要性。
圖 1.使用針對減數分裂紡錘體（紅色）和中心體（綠色）中蛋白質的抗體，對處於減數分裂中期 II (MII) 階段的小鼠卵母細胞進行顯微免疫染色分析。染色體以DAPI（藍色）複染。
研究 1：以 HP-SPME-GC-MS 測量胚胎學研究所需超純水中的 BPA 含量
在生殖生物學中，水是用於進行分析的關鍵試劑（例如培養基製備）。
義大利帕維亞大學的科學家使用可再現的 HP-SPME-GC-MS 方法，分析了胚胎學研究中使用的超純水中的 BPA 含量。所分析的超純水來自 Milli-Q® IQ 7000 超純水系統，該系統的進水是 Elix® 純水，產自採用多種純化技術組合的系統，包括先進的逆滲透 (RO)、Elix® 電去離子 (EDI) 和殺菌紫外燈，類似於 Milli-Q® HX 水系統。Milli-Q® IQ 7000 超純水系統在取水點裝有Biopak® 精濾器（圖 2）。對於分子生物學應用，建議使用Biopak® 超精濾器，以提供不含內毒素、核酸酶、蛋白酶和細菌的純水。
圖 2.使用 HP-SPME-GC-MS 對不同類型的實驗室水中的雙酚A (BPA) 進行實驗分析的概覽。
HP-SPME-GC-MS 分析顯示，在實驗室實驗中所使用的 Elix® 純水和 Milli-Q® 超純水中，均未檢測到 BPA，數值在 4 nM的檢測極限 (LOD) 內 （表 1）。
如前所述，實驗用水來自Biopak® 精濾器。圖 3 顯示了從裝有Biopak® 精濾器的 Milli-Q® IQ 7000 系統取水點，連續取用的三個水樣進行分析所獲得的典型結果。根據下文“材料與方法”一節中的步驟，評估了 GC-MS 分析的再現性與穩健性以及 BPA 的每日變化。
結果表明，Milli-Q® IQ 7000 系統獲得的超純水檢測不到 BPA (LOD = 4 nM)。尤其是分析結果也顯示，BPA 不會從系統溶出到產水中，因為在供給純水系統的自來水中未檢測到 BPA 。
圖 3.顯示三個超純水樣品中 BPA 含量的層析圖譜。這些樣品連續取自於裝有Biopak® 精濾器的 Milli-Q® IQ 7000 超純水系統取水點。
以下兩項研究表明，可以放心使用Milli-Q® 超純水系統來生產無 BPA 汙染的優質純水，且可進一步用於研究環境賀爾蒙對發育中的配子和胚胎的影響，特別是經過 Biopak® 精濾器過濾後的純水。
研究 2：以不含 BPA 的超純水進行細胞學和分子分析，來評估 BPA 對卵母細胞成熟的影響
當測量特定分子的影響時，實驗環境必須不含待測分子。在本研究中，科學家使用 qRT-PCR 分析了四種母體效應基因 Brg1 （染色質重塑基因）、 Dnmt3a和 Dnmt3l （DNA 甲基化酶）、以及 Oct-4（細胞多能性標記）的轉錄表達。樣品由三個獨立的樣品池組成，每個池中含有 10 個中期 II (MII) 小鼠卵母細胞，這些卵母細胞是在分別存在10 nM、100 nM 或 1000 nM BPA 的情況下，在完全生長的竇卵母細胞體外成熟 (IVM) 15 小時後獲得的。
結果顯示，在測試的三種劑量下，BPA 並未阻止減數分裂成熟，因為絕大多數 (96.5%) 卵母細胞已達到 MII 階段，對照組 (CTR) 與暴露樣品之間沒有顯著差異。然而，在所有受測 BPA 濃度下，所有受測基因的表達均發生了顯著改變（與未處理的對照相比更高或更低），但Oct-4除外，在 10 nM BPA 下未發生改變（圖 4）。
這些基因表達實驗是使用裝有 Biopak® 精濾器的 Milli-Q® IQ 7000 純水系統所生產的超純水進行的。結果表明，從該 Milli-Q® 系統取用的超純水，適用於生殖生物學中對 BPA 敏感的應用。
圖 4.在 GV 向 MII 轉變期間暴露於 10、100 或 1,000 nM BPA 的小鼠卵母細胞中 Brg1, Dnmt3a、 Dnmt3l 、Dnmt3l 和 Oct-4 母體效應基因的表達情況圖。將對照 (CTR) 樣品的表達值設置為 1，以計算 n 倍變化。數值以平均值 ± SD表達。*p < 0.05 **p < 0.001.
研究 3：以不含 BPA 的超純水製備用於細胞成像技術培養基
延時成像使我們能夠觀察卵母細胞從生發囊泡 (GV) 過渡到 MII 發育階段期間發生的內部運動（影片4）。這些運動被稱為細胞質運動速度 (CMV)，可作為一種非侵入性細胞學標記，來評估雌配子發育能力（配子的品質及維持進一步發育的能力）。5,6在所報告的研究中，這項新技術已被用於研究在不存在或存在 BPA 濃度增加的情況下，成熟卵母細胞從 GV 至 MII 轉變過程中發生的 CMV（圖 5 僅顯示了 100 nM BPA 的代表性數據）。
細胞粒子圖像速度 (細胞 PIV) 分析顯示，當卵母細胞對受測 BPA 劑量敏感時，存在特定的發育時間窗口。值得注意的是，當暴露於低濃度 10 nM BPA 時，CMV 的變化分散在單個時間點，而在較高劑量下，CMV 的變化在 GV 至 MI 過渡期間的長時間區間中可見。具體來說，100 nM BPA 在染色質凝結和著絲粒聚集成大染色中心形成 MI 板時的時間間隔內導致顯著差異（圖 5）。
上述 CMV 實驗中涉及的培養基是用裝有 Biopak® 精濾器的 Milli-Q® IQ 7000 純水系統提供的超純水製備的。分析結果證明了對不含 BPA 培養基的需求，因為即使是 100 nM 低劑量的 BPA 也可能產生影響，這可以透過基因表達或細胞質運動分析檢測得來。
圖 5.(A) 在第 1 幀 (a) 拍攝的 GV 卵母細胞和在第 100 幀 (b) 拍攝的 MII 卵母細胞的代表性圖像。插圖顯示了帶有箭頭（速度向量）的放大圖像，指示了細胞質運動的強度和方向。箭頭的顏色和長度表示與前一幀相比的運動速度模組。彩色向量比例尺（nm/min）：藍色表示低速；紫色表示高速。比例尺：10 μm.(B) 在不存在（綠色）或存在（灰色）100 nM BPA 的情況下，小鼠卵母細胞 GV 轉變至 MII 過程中的細胞質運動概況圖。*p < 0.05.
結論：適用於胚胎發育研究中對 BPA 敏感應用的超純水
隨著研究技術的靈敏度與性能的不斷提升，日益需要更優質的純水，以免造成汙染，影響實驗結果準確性和真實性。特別是在涉及高度突破性研究工具的研究中，科學家需要高純度水來防止任何可能干擾分析結果的問題（例如 BPA、內毒素、核酸酶、蛋白酶和細菌），以提高實驗分析的信心。
在胚胎學領域，即使是低含量的內環境賀爾蒙 BPA 也已被證實會透過干擾卵母細胞的生長令胚胎發育研究結果大打折扣。這是令人擔憂的問題，雖然 BPA 不一定存在於實驗室的自來水中，但它可以從實驗室耗材和設備中溶出，進而干擾實驗結果。
在本文中，儘管我們已經顯示低含量 BPA 不會阻止減數分裂成熟，但僅僅 10 nM 的極低 BPA 濃度，亦會影響基因表達以及卵母細胞從生發囊泡 (GV) 發育過渡到 MII 期間發生的卵母細胞內部運動。這些結果突顯出需要在不含 BPA 的環境中進行胚胎學實驗，包括使用確保檢測不到 BPA 含量的超純水。
根據本文所使用的方法，配備 Biopak® 拋光機的 Milli-Q® IQ 7000 超純水系統提供的超純水不含可偵測到的 BPA，檢測極限甚至非常低，只有 4 nM。因此，該系統提供的超純水可以放心地用於研究環境賀爾蒙對發育中的配子和胚胎的影響。
尋找適合 BPA 敏感分析需求的純水解決方案，請連絡實驗室水專家的支援。
用HP-SPME-GC-MS 分析 BPA 所使用的材料與方法
儀器設備
- 水分析使用載有 CombiPAL 自動採樣儀（瑞士 CTC Analytics）的 Thermo Scientific DSQII 單四極桿 GC/MS 系統（TraceDSQII 質譜儀、TraceGCUltra 氣相色譜儀）。
- 使用長 30 mm、內徑 0.25、膜厚 0.25 µm 的 Restek Rxi™ - 5 ms 毛細管柱（5% 二苯基 / 95% 二甲基聚矽烷 – 美國 Bellefonte 的 Restek Corporation），以氦氣作為載氣，恆定流速為 1.0 mL/min。
- 使用了 100 µm 聚二甲基矽氧烷 (PDMS) SPME 纖維組件。每次分析前，請在 250 °C 的針頭加熱器中清潔纖維 20 分鐘，以避免先前分析的殘留。
標準品製備
在 100% 乙醇中製備濃度為 10 nM 的 BPA 原液。使用 HPLC 水進行一系列稀釋，以獲得四種不同濃度等級（1、2、4、40 nmol/L）的校準曲線。
實驗1：評估 GC-MS 分析的再現性和穩健性
從三個來源中連續採集三個水樣 (5 mL)：自來水、Elix® 純水、以及裝有 Biopak® 精濾器的Milli-Q® IQ 7000 超純水系統的取水點取用的純水。取水前先以 5 L 水沖洗系統。
實驗2：評估 BPA 濃度的每日變化
每24小時一次，連續三天從三個來源中連續採集三個水樣 (5 mL)：自來水、Elix® 純水、以及裝有 Biopak® 精濾器的Milli-Q® IQ 7000 超純水系統的取水點取用的純水。取水前先拋棄 5 L 水。層析圖譜可供索取。
水樣
將5 mL 待分析水（指自來水、Elix® 純水、以及 Biopak® 過濾的超純水）加入 20 mL 玻璃小瓶中。在每個小瓶中，添加 200mg KHCO3和 1 g NaCl，並放入一根不重覆使用的磁力攪拌棒。
衍生反應
將 30 µL 乙酸酐加到水樣中，並用帶有聚四氟乙烯面隔膜的頂空鋁蓋密封小瓶。在 80℃下，衍生化反應 5 分鐘（以 50 rpm 連續攪拌），達到完全反應。使用 100 µm PDMS 纖維在 80 °C 下攪拌 (500 rpm) 30 分鐘，進行 BPA 的頂空萃取。SPME 纖維在注射器中，於 250 °C 下解吸 2 分鐘。
圖譜分析
烘箱溫度保持150 ℃ 持續2 分鐘，以 每分鐘30 ℃的速率升高至 280 ℃ 並持續 6 分鐘。進樣採用不分流模式，不分流時間為2 分鐘，PTV 進樣器溫度保持在 250 °C。 傳輸線保持在 290 °C，離子源保持在 250 °C。MS 在電子轟擊電離 (EI) 模式下運行，離子在全掃描模式下（質量範圍為 m/z 35-350 amu）和 SIM（選擇監測）模式下（使用 m/z 270 作為 BPA 的定量離子）進行登記。
銘謝
作者在此感謝義大利帕維亞大學發育生物學實驗室進行本研究，亦感謝我們的研發同事對本項目的貢獻。
參考文獻
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