Western Blotting 的載入對照
Chandra Mohan, Ph.D., Wayne Speckmann, Ph.D, Robin Clark, Ph.D
自從第一篇描述Western blotting（Renart et al.，1979）的文章發表以來，這種免疫檢測技術已被廣泛用於鑑定從細胞或組織中提取的複雜混合物中的特定蛋白質。Western 印跡技術有三個基本要素：1 依蛋白大小分離蛋白質，2 轉移到固體支持物上，3 使用適當的第一抗體標記目標蛋白質，然後顯示，通常使用結合的第二抗體。隨後工具和技術的改進，以及高靈敏度螢光標籤的開發，大大提高了檢測的限度，使科學家能夠探查特定組織的正常和疾病通路。然而，當科學家使用定量 Western 印跡來識別蛋白水平的變化時，通常會面臨一些困難。這是由於許多蛋白質在不同的組織、不同的生理和病理條件下表現出不同的表達模式。
Western印迹：不简单的常规技术
虽然Western印迹可能是最常用的免疫应用，但仍有一些关键的技术问题可能长期被忽视。例如，分離或分離協議是否會影響蛋白質的完整性或其轉譯後修飾？能否區分降解或聚集的蛋白質與生物過程的相關產物？當結果是多條帶時，如何判斷哪些是結果、哪些是變異、哪些是假象？(Gorr and Vogel, 2015)
定量 Western 印迹可用于比较一组样本中目标蛋白质的相对数量，这些样本可能代表不同的个体、治疗条件、疾病状态或其他生物变量。為了準確鑑別和測量多個樣本的總蛋白質含量，科學家可能會使用「載荷對照」作為內部標準。上載對照物是指加入一抗假定存在於所有樣本中的蛋白質的一抗，其相對豐度不受生物變異或實驗條件的影響。使用上載對照允許量化所有孔中的樣品上載量，以便在不同樣品通道之間上載對照相同的假設下對結果進行規範化。使用載量對照還可以防止 「邊緣效應」（edge effect），這是使用大量泳道時常見的情況，外側泳道中的蛋白轉移到膜上更靠近框架的位置，導致印跡邊緣染色更強。載荷對照可用於顯示蛋白質載荷是否發生變化，並可能解釋觀察到的目標帶變化。如果使用正確，上載控制可確保蛋白質得到適當的定量，儘管在 Western 印跡的所有泳道上，上載量存在微妙的差異。
Western blot 針對 β-actin (A5316)的單株抗體驗證。在定量 Western 印圖中，通常會選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH 等構性表達蛋白作為載荷對照。使用上載對照有助於確保目標蛋白豐度的明顯變化是由相關的生物變異引起的，而不是由凝膠上載的總蛋白量不一致引起的。下表列出了可用作 WB 負載對照的其他特定於樣本和條件的抗體。
選擇上載控制抗體
β-actin和β-tubulin一直被用作上載控制， 因為它們的表達在大多數模型系統中是相對構成的。 然而，一些出版物質疑使用β-肌動蛋白作為標準上載對照的有效性（Ditmar and Ditmar, 2006; Eaton et al.這些刊物的作者建議使用總蛋白分析作為定量 Western 印跡的替代技術，並建議在研究被研究基因的表達模式後，應小心使用「看家」基因產品。儘管如此，β-actin 和 β-tubulin（β-管蛋白）作為載荷對照品具有一定的優勢：它們高度保守、表現出較高的表現水平，並且在大多數實驗條件下表現出穩定性。值得注意的是，必須根據研究的特定組織或細胞類型來選擇對照，而且可能需要經驗測試來驗證上載對照的一致性。
從載荷對照抗體得到有效結果的提示
為了克服 Western 印圖中的變異性和減少數據解釋中的錯誤， 以下一些預防措施可能會有所幫助。
- 使用穩定表達且受實驗條件影響最小的內部負載對照。
- 選擇針對已知在您的樣品中組成性表達的蛋白質的負載對照抗體。
- 上載對照應覆蓋廣泛的分子量範圍，因此選擇的對照應在相似的 MW 範圍內，但不是與目標蛋白相同的 MW。
- 上載對照抗體通常檢測大量表達的看家蛋白，導致信號飽和，尤其是使用化學發光檢測方法時。過飽和會使上載對照條帶失去參考價值，也可能掩蓋樣本與樣本之間在目標蛋白數量上的差異。
開始前，用要使用的樣本試測上載對照的抗體濃度和印圖曝光時間，以確保上載對照信號在檢測的線性範圍內。
參考資料
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？