用胃蛋白酶消化的抗體碎片

胃蛋白酶是一種內肽酶，可將蛋白質分解成較小的肽。它產生於胃黏膜的胃首部細胞，是蛋白質消化所需的酵素，是人類和許多其他動物消化系統中的主要消化酵素之一。胃蛋白酶是肽酶 A1 家族的成員，對蛋白質中的疏水性、芳香性區域有優先裂解作用。

胃蛋白酶消化抗體製備 F(ab')2

胃蛋白酶在抗體研究中被廣泛用於消化免疫球蛋白、二價抗原結合片段（F(ab')2）和其他蛋白質。它可用於分離 F(ab')2 區域與各種免疫球蛋白異型（如 IgG 和 IgA）的 Fc 結構域。與木瓜蛋白酶不同，胃蛋白酶裂解的結果是 Fab 結構域的兩條鏈都連接起來，因為裂解是朝向連接鏈的二硫鍵的 C 端發生的，如 圖 1 所示。

圖 1. 用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶分割抗體的示意圖。

F(ab「)2的分離在免疫學研究應用中非常有用，因為它保持了二價抗體的誘導性，卻沒有Fc域1的補體Fc受體結合功能。F(ab」)2分離還有幾個優點，包括與更小的片段（scFv）相比，穩定性更好，而且小尺寸使其具有更好的通透性，更容易與配體接觸。提高胃蛋白酶消化抗體的可靠性和效率，我們的專家用胃蛋白酶校準了單克隆和多克隆抗體的Cat No: P6887），以達到快速、簡單、完整的消化。

圖 2. P6887 單株抗體的時間過程。

圖 3. P6887 多克隆抗體的時間過程。

使用胃蛋白酶消化方案獲得的數據表明，使用胃蛋白酶（Cat No: P6887）可快速消化單克隆和多克隆抗體，同時保留 F(ab')2 特異性（見圖 4）。

圖 4. 用胃蛋白酶消化多克隆和單克隆抗體。不同時期胃蛋白酶處理抗體的 SDS-PAGE 分析。SAB4200872：兔製的抗 SARS-CoV-2-Spike 蛋白 C 端抗體；SAB4200881：抗β-乳球蛋白抗體，小鼠單克隆。

圖 5. Western blot 分析胃蛋白酶處理的抗體在不同的時間段都有活性並能結合其靶點。第 1-6 樣道對應於上述 SDS-PAGE 中的樣道。第 7 線：陰性對照；SAE1000：SARS-CoV-2 受體結合域；L3908：β-乳球蛋白。

圖 6. Western blot 分析胃蛋白酶處理的抗體在不同的時間段都有活性並能結合其靶點。第 1-6 樣道對應於上述 SDS-PAGE 中的樣道。第 7 線：陰性對照；SAE1000：SARS-CoV-2 受體結合域；L3908：β-乳球蛋白。

胃蛋白酶消化材料
Reagent	CAT NO.:	抗體		25-35 mg
	10 mg
0.1M 檸檬酸鈉緩衝液 pH 3.5	C1909	21 g
0.	5N NaOH	S5881	20 g
2M TRIS-base	T1503	25 g
磷 酸 鈉 緩 衝 鹽 水 (PBS) 0.01M, pH 7.2-7.4	P5119	100 ml
Sodium Azide 1.5M	71290	1 ml
純水		1L

胃蛋白酶消化協議

1. 濃縮抗體至 25-35 mg/ml。
2. 交換緩衝液至 0.1M 檸檬酸鈉緩衝液 pH 3.5。注意：已測試在 4 °C 下透析過夜即可
3. 將 10 mg 胃蛋白酶 (P6887) 溶於 1 ml pH 3.5 的 0.1M 檸檬酸鈉緩衝液中
4. 將溶解的胃蛋白酶加入抗體溶液中。胃蛋白酶應以 3% (w/w) 的比例加入目標抗體。(如果處理 10 mg 抗體，加入 30ug 胃蛋白酶或 30L 胃蛋白酶溶液）
5. 在 37 °C 下孵育 1-2 小時。
6. 用 2M TRIS-base 滴定至最終 pH 8 停止反應。0.
7. 以 0.01M PBS pH 7.2-7.4 (加入 15mM Na Azide 作保存) 或您偏好的緩衝液對抗體進行糖化，4 °C過夜.

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參考資料

1. Liu C. 1999. Preparation and purification of F(ab?)₂fragment from anti hepatoma mouse IgG₁mAb. WJG. 5(6):522. https://doi.org/10.3748/wjg.v5.i6.522