蛋白質的定向演化方法
蛋白質是生物體的功能主力，由相互連結的氨基酸鏈組成，這些氨基酸鏈共同形成肽，並最終決定了蛋白質的三維結構和功能。氨基酸序列和蛋白質結構的有益變化，很可能是進化和各種自然選擇壓力的結果，通常是一個緩慢但必要的過程，讓生命能夠回應和適應環境的變化。定向進化大大提高了變化的速度，它模擬了自然進化的過程，產生了具有多種特性的蛋白質庫，有時還能增強功能。酵素的定向演化以及抗體和肽的噬菌體顯示令酵素學、藥物開發和醫學領域出現創新，已獲得國際認可，該領域的先驅獲頒 2018 年諾貝爾化學獎。
利用新蛋白設計（de novo）和理性蛋白設計（rational protein design）調整蛋白功能
新蛋白設計（de novo）涉及蛋白結構動機預測，並使用比較建模和折疊識別方法得出三維結構。1然而，由氨基酸序列推導出的預測蛋白質主動結構可能無法為目標蛋白質帶來相同的功能。在合理設計的工作流程中，序列-結構-功能的教條構成了核心基礎，包括找出要突變的目標胺基酸，然後進行定點突變和其他方法，如下所述。2理性設計的挑戰包括蛋白質的低表達、穩定性以及達到所需的功能。要將這種方法擴展到特定蛋白質中的每個氨基酸也很困難。
定向进化和模拟自然选择
定向进化是一种设计具有理想功能的蛋白质的稳健方法。與理性方法不同的是，定向進化會在感興趣的基因中產生隨機突變，並且不需要蛋白質結構資訊。導向進化模仿自然進化，透過嚴格的選擇和篩選方法，找出具有最佳功能的蛋白質，包括基因多樣性、結合性、催化性、熱穩定性和環境穩定性。3
定向進化的歷史
隨著 1967 年自我複製 RNA 的產生，定向進化方法在接下來的三十年間經歷了徹底的成長。在 1980 年代，基於噬菌體顯示法的 體外選擇方法被成功地用於富集所需的蛋白質。1985 年，PCR 的發現使得隨機突變和飽和突變方法得以使用，如表 1 所示。之後，定向進化方法改善了許多酵素的功能性和對映選擇性，並被廣泛地用於新陳代謝通路和各種基因組的量身訂做4,5
。定向進化實驗設計
定向進化實驗包括三個基本步驟，即突變、篩選和基因擴增。
突變蛋白庫的產生
在產生突變蛋白庫時，為所需的功能多樣性或底物特異性定義蛋白工程目標是至關重要的。使用有益突變體比有害突變體比例較高的目標文庫通常是一個有效的起點。6最常見的方法包括易出錯的 PCR 和 DNA 洗牌法。
選擇和篩選
在創造基因多樣性之後，突變體通常會轉換到細菌或酵母宿主中進行蛋白質表達，並進行功能性篩選。篩選過程會剔除無功能的變異體，主要是以質粒、噬菌體或核糖體顯示、生長互補和記錄器為基礎的策略。在篩選過程中，會評估個別蛋白質變體是否具有所需的活性。高通量方法可有效篩選所需的功能，包括以下工具和方法：直接微孔板、數位影像與光譜學結合、區隔、FACS（螢光活化細胞分選）、細胞表面顯示、共振能量轉移、核磁共振 (NMR)、高效液相色譜法 (HPLC)、氣相色譜法和質譜法。7篩選後會找出功能最佳的理想克隆，並作為下一輪基因操作的範本。
基因擴增
最後一個步驟是選擇最佳的突變序列或序列庫，以 PCR 方式進行擴增。使用最佳序列，重複整個誘變、篩選、選擇和基因擴增週期，直到找到含有蛋白質工程目標所定義的所需特性的突變體為止。
圖 1：定向演化週期的步驟定向演化週期的步驟
利用定向進化的應用和成功的蛋白質工程
利用各種突變方法重新設計蛋白質改善了許多酶在耐熱性、特定活性、親和性、溶解性、穩定性和對映選擇性方面的功能。Table 2 highlights some key enzymes that were identified using directed evolution.8
細胞色素 P450 工程的成功故事
細胞色素 P450 酵素是哺乳類動物藥物代謝途徑的一部分。它是一種用途廣泛的酶，具有巨大的底物範圍。P450 酵素的定向進化已導致催化作用的多樣化，並發現了具有非天然 P450 化學作用的新生物催化轉換。P450 的基因調整是一個生物變化的例子，它導致新化學物質的產生，並將酵素的反應空間擴展到一個新的生物合成途徑。9重要的是，計算預測與定向演化方法的整合將可能加速並加強我們對新蛋白質功能的理解。10
Kapa Biosystems 試劑來自定向進化方法
定向進化是生命科學的一大福音，與自然進化過程相比具有優勢。我們的 Kapa Biosystems reagents 採用定向進化方法，促進實驗室中的自然選擇，產生優化的酵素，用於多種生命科學應用，如 PCR、定量 PCR (qPCR)、下一代測序和分子診斷。
市售的 PCR 試劑包括來自 Thermus aquaticus 的「野生型」重組 DNA 聚合酶 (Taq 聚合酶)。然而，我們的 Kapa Biosystems 試劑由新型聚合酶組成，採用定向進化技術合成，具有增強的特異活性、更高的保真度、更高的處理能力，並能抵抗常見的 PCR 抑制劑。Kapa Biosystems 為基因擴增的 PCR、qPCR 和 qRT-PCR 套件提供多樣化的試劑。
Kapa Biosystems PCR 和 qPCR 應用
Kapa Biosystems 蛋白質來自於定向進化方法，與野生型蛋白質相比，Kapa Biosystems 蛋白質包含了許多既多樣又獨特的增強功能。定向進化方法產生的增強酵素與緩衝劑和額外酵素等額外因素的結合，使 Kapa Biosystems 套件如此具有影響力。例如，KAPA Long Range PCR Kits 包含 Taq DNA 聚合酶和具有校對活性的改良古生動物 (B-family) DNA 聚合酶。KAPA2G Fast Multiplex PCR Kits(見圖 2），其延伸時間顯著快於野生型 Taq，已被用來分析三種單核苷酸多態性 (SNP's；rs1049673、rs3211931 和 rs3212162)，方法是使用多重 PCR 擴增，然後再進行單一碱基延伸。12
圖 2： KAPA2G 快速多重 PCR 試劑盒：使用 KAPA2G 快速多重 PCR 試劑盒、Competitor Q 和 Competitor I 進行 6-plex 多重 PCR，使用相同的循環條件 (30 cycles)。
Kapa Biosystems qPCR 試劑和試劑盒已經過優化，可以鑑定低拷貝和難以鑑定的靶點，並提高重現性。為了分析粗糙樣本，KAPA PROBE FORCE qPCR 試劑盒含有一種母液混合物，無需進行 DNA 純化，並能抵抗血液、組織和植物樣本的抑制劑。此外，KAPA PROBE FAST qPCR Kit（圖 3）適合使用序列特異性螢光探針化學試劑（如水解探針、FRET 探針和位移探針）進行極靈敏和準確的實時 PCR。KAPA PROBE FAST qPCR 已被用來測定 SOX7 mRNA 和其他發育上重要因子的表達水平13
。
圖 3： KAPA SYBR® FAST 試劑盒：KAPA SYBR® FAST 在使用人類基因組 DNA 進行 DMD 和 NOTCH 目標基因擴增時，與競爭對手的試劑盒相比，具有更優異的性能和定量。
摘要
定向進化是改善蛋白質功能的強大策略。當生物功能模糊不清或對底物和蛋白質結構的化學知識有限時，定向進化可產生數以千計的變體，利用高通量篩選得出最佳解決方案。定向進化已經產生了許多工程蛋白質，包括藥品的純異構體和用於關鍵生命科學應用的蛋白質。由於透過定向進化可快速產生新蛋白質，因此工程蛋白質和酶將可能繼續在促進我們對許多生物過程和生物催化的了解上產生重大影響。
參考資料
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？