HDM-PAMPA 搭配 MultiScreen 滲透性濾板

在藥物發現過程中，預測口服藥物被動吸收的檢測方法變得越來越重要。正如Faller¹和Kansy²先前所描述的，這種檢測提供了快速、低成本和自動化友好的方法來測量化合物的被動滲透性。HDM-PAMPA (HDM = 十六烷法) 方法是一種不以細胞為基礎的檢測方法，設計用來在早期藥物發現中預測藥物的被動、跨細胞滲透性。該檢測在 96 孔 MultiScreen Permeability 板 (MPC4NTR10) 中進行，測量化合物從聚碳酸酯膜支持物上被十六烷液層分隔的 Donor 室向 Acceptor 室擴散的能力。

實驗材料

試劑

• 十六烷（例如：# H6703; Sigma Chemical Co、St.Louis, MO）
• 己烷（例如：# 27050-4；Sigma）
• 磷酸緩衝生理鹽水（例如：# P-3813；Sigma）
• 胰蛋白酶（例如：# P-3813；Sigma）
• 胰島素（例如：# P-3813；Sigma）

設備

• 多孔篩^®過濾板（# MPC4NTR10；Millipore Corporation, Billerica, MA）
• PTFE接受板，可選（# MSSACCEPT0R；Millipore）或隨檢測板提供的96孔接受板
• Spectramax^® Plus 微孔板閱讀器 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 或類似的 UV-Vis 閱讀器
• SoftMax^® Pro 軟體 (Molecular Devices) (選購)
• UV 相容的石英板 (例如： # R8024; Molecular Devices)：# R8024; Molecular Devices）或 96 孔 Costar^®，帶紫外透明底（例如：  #3635 ; Corning Inc.,Corning, NY）或 Greiner UV-Star Plates-96 孔平底 #655801 (Greiner Bio-One, Inc、Longwood, FL)
• Polypropylene reagent reservoirs (for example: # 175-RBAS-000; ELKay laboratory consumables Shrewsbury, MA)
• Multichannel pipette such as:
  • Finnpipette^®電子移液器（# 21377232；Thermolab Systems，Helsinki，Finland）
  • Biohit^®

測量十六烷膜的完整性（正確形成）：

• 歐姆計（#EVOMX-G，World Precision Instruments，Sarasota，FL）
• 96孔跨上皮電阻（TEER）測試盤（#MULTI-96 World Precision Instruments Sarasota，FL）<

步驟

1. 製備正己烷中5%的十六烷溶液（v/v）（~3 mL/板）。
2. 小心移取 15 µL 十六烷/正己烷混合物至每孔膜上，但避免移液器吸頭接觸膜。
3. 讓平板在通風罩中乾燥 1 小時，以確保正己烷完全蒸發，形成均勻的十六烷層。See Notes 1, 2.
4. 在受体板的每个孔中加入 300 µL 缓冲液（5% DMSO in 磷酸盐缓冲盐溶液 pH 7.4）。 See Note 3.
5. 将受体板放置在通风橱中 1 小时。
6. 將經十六烷處理的 Donor 板放入 Acceptor 板中，確保膜的底部接觸到各孔中的緩衝液。
7. 將所需藥物溶於 5% (v/v) DMSO/PBS 至所需濃度，並加入 150 µL 至 Donor 板的各孔中。
8. 置換板蓋，室溫孵育 5 小時。 請參閱註釋 4。
9. 孵育後，分析受體板的化合物濃度。(見註 5）
10. 按理論平衡配製藥物溶液（即、
11. 用於確定滲透率 (P_e) 的方程式顯示於 圖 1，並計算 log P_e。公式的變量定義在表 1中。

圖 1. 對數 P_e 可根據 Faller 等人 (1) 所報告的公式計算出來

表一 用於計算 Log P_e 的變數說明

註釋
VD	以 cm3 表示，150 µL = 0.15 cm3
VA	受體室的體積	以 cm3 表示，300 µL = 0.30 cm3
Area	定義為膜面積 x 孔隙率。對於 MultiScreen 滲透性濾板中的膜，面積 = .24 cm2 x 20%；或 .048 cm2
測試的孵育時間	以秒為單位，1 小時 = 3600 秒
[drug]acceptor	化驗完成時接受體區間化合物的吸光率單位	[drug]equilibrium	上述步驟 9 中理論平衡時化合物的吸光率	SoftMax Pro 軟體記錄的平衡樣品的吸光率

Note 1: 為了獲得一致且最佳的性能，讓正己烷完全蒸發是非常重要的。

註 2: 一旦蒸發完成，十六烷膜就可以穩定地使用幾個星期。

註 2：  為了確保十六烷層完好無損，可以在進行滲透性測試之前和之後進行電阻測量。完整的十六烷層具有極高的電阻（通常超過 25 kΩ）。

註 3：  在滲透板的包裝中包含一個接受板。

注意 4: 為避免蒸發，培養期間應將平板放置在濕度可控的環境中，例如使用濕紙巾的密封容器中。

註 5: 一般建議使用 96 孔 UV/Vis 平板閱讀器進行樣品分析。樣品定量技術，如在寬吸光範圍（如 250-500 nm）內掃描、單一波長 (λ_max) 或預先選擇的固定波長求和，都是可以接受的分析方法。HPLC-UV 或 LC-MS/MS 也是可選擇的檢測方式。

參考資料

1. Wohnsland, F.; Faller, B. High-throughput Permeability pH Profile and High-throughput Alkane/Water Log P With Artificial Membranes, J. Med. Chem., 2001; 44, p. 923–930.

2. Kansy, M.; Senner, F.; Gubernator, K. Physicochemical High Throughput Screening: Parallel Artificial Membrane Permeation Assay in the Description of Passive Absorption Processes, J. Med. Chem., 1998; 41, p. 1007–1010.