高靈敏 IFN-γ ELISpot 分析法

Cindy Chen, Ph.D., Jun Park, Ph.D.

Merck

簡介

ELISpot（酶聯免疫斑點）檢測法發展於 1983 年，它提供了一種在單細胞水平上測量免疫細胞產生抗體或細胞因子的有效方法 。^1,2近年來，隨著研究人員嘗試更好地了解免疫反應的各種應用，包括研究免疫記憶和疫苗開發，這種檢測方法的流行程度又有回升。³ 

本研究提供了一個典型的 ELISpot 分析例子，用來量化從先前感染巨細胞病毒 (CMV) 的捐贈者身上取得的外周血單核細胞 (PBMC) 樣本中已存在的抗原反應性 T 細胞的數量。由於可以依據 CMV 抗體的血清狀態取得 PBMC，因此可以比較 CMV 血清陽性與 CMV 血清陰性族群的 T 細胞γ干擾素 (IFN-γ) 免疫反應，前者的族群可能已發展出針對病毒的記憶 T 細胞。

由於微孔膜比標準的聚苯乙烯表面具有更好的結合特性，目前大多數 ELISpot 分析都是在聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜過濾板上進行的。由於 ELISpot 的讀數是每孔的點數，PVDF 膜的白色為點數檢測和分析提供了理想的背景。

在標準的 ELISpot 分析（圖 1）中，細胞特異性抗體被固定在 96 孔膜過濾板上。接下來，細胞會在有或沒有刺激物的情況下播種。活化的細胞會開始分泌細胞因子，這些細胞因子會與表達細胞附近的擷取抗體結合。接著洗掉細胞，然後透過一步法（酵素結合、細胞激素特異性抗體）或兩步法（生物素化抗體/鏈霉親和素-酵素）的抗體結合過程後的底物沉積，完成斑點偵測。

我們使用 MultiScreen^® HTS-IP 篩選板進行 ELISpot 分析，從分離的 PBMC 識別和誘集 CMV 反應性細胞製素分泌細胞。^4,5ELISpot檢驗法可以在CMV肽的刺激下，枚舉分泌IFN-γ的個別細胞。該檢測方法靈敏度高，可在單細胞水平進行檢測。此模型在抗病毒疫苗開發中具有潛在應用價值，可通過比較接種疫苗之前和接種疫苗之後臨床樣本中的細胞反應來評估疫苗的療效。

第 1 天：在 4 ºC 下用捕獲抗體塗佈過夜。

第 2 天：裝入 PBMC 和多肽，在 37 ºC 孵育細胞過夜。

第3天：加入檢測Ab顯影斑點，並加入阿維丁結合物和底物；讀取並分析數據。

圖 1. ELISpot 工作流程。

Materials and Methods

Reagents

• Single-donor peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (CMV-seropositive and CMV-seronegative donors ages 20-30, AllCells)
• MultiScreen^® HTS-IP 篩選板 (Merck, #MSIPS4510)
• 抗人類 IFN-γ (MabTech, #3420-3-250)
• 抗人類 IFN-γ生物素化（MabTech，#3420-6-250）
• 鏈霉親和素-HRP（MabTech，#3310-9-1000）
• TMB底物（MabTech，#3651-10）
• 人類CD4和CD8 T細胞的CMV多肽池（MabTech，#3619-1）
• RPMI 1640 + 10% FBS
• PMA (Merck, #5005820001)
• Ionomycin (Merck, #I3909)
• 35% 乙醇
• 無菌水
1X PBS

板製備

1. 在第1天，用15 µL的35%乙醇預先濕潤孔，少於1分鐘，然後彈去乙醇，以避免排水不足
2. 在第2天，用15 µL的35%乙醇預先濕潤孔，少於1分鐘，然後彈去乙醇，以避免排水不足
3. 用 200 µL 無菌水洗孔 4 次
4. 每孔加入 100 µL 捕獲抗體（10 µg/mL 終極濃度，1X PBS），4 ° C 孵育過夜。C 下孵育過夜

分析

1. 第 2 天，用 1X PBS 洗板 3 次（每孔 200 µL ）
2. 板用 RPMI 1640 + 10%FBS 培養基（每孔 200 µL 每孔）在室溫下調節 30 分鐘
3. 將細胞接種到孔中，在組織培養箱（37 °C，5% CO2）中不受干擾地培養過夜（16-20 小時）：
   • 來自 CMV 血清陽性和 CMV 血清陰性供體的 PBMC：每孔100 µL 50,000, 25,000, 12,500 cells in complete media containing CMV peptides (2 µg/mL final concentration)
   • 阳性对照：100 µL PBMCs activated with ionomycin (0.3 µM）和 PMA（0.2 µM）
   • 陰性對照（血清陽性供者的 PBMCs，在沒有 CMV 肽刺激的情況下）：100 µL 每孔 50,000 cells in complete media
4. 第 3 天，吸出平板去除細胞；用 1X PBS 洗孔 4 次（每孔 200 µL）
5. 平板在室溫下與生物素化檢測抗體（0.25 µg/mL in 1X PBS + 0.5% FBS, 100 µL per well）
6. 平板用 1X PBS 洗 5 次（200 µL per well）
7. 每孔加入 100 µL 1:1000 Streptavidin-HRP （在 1X PBS + 0.5% FBS），室溫孵育 1 小時
8. 用 1X PBS 洗孔 5 次（每孔 200 µL）。
9. 加入 TMB 底物（每孔 100 µL），顯色至有光點出現（約 5 分鐘）
10. 用 ddH2O 洗孔，停止顯色
11. 膠片表面的底物（每孔 100 µL）。li>用 ddH₂O 沖洗膜底部，然後讓膜乾燥
12. 使用 Keyence™ VHX-2000 直立式顯微鏡檢查每一孔。以數位方式擷取影像，並用於手動計算點數

Results

本研究使用了來自 7 位年齡介於 20 到 30 歲的捐贈者的 PBMCs，包括 CMV 血清陽性 (N=4) 和 CMV 陰性 (N=3)。作為陽性對照，用 PMA-ionomycin 活化 PBMC，以建立 IFN-γ 反應的檢測（圖 2）。IFN-γ反應可清楚觀察到，肉眼檢測到大量的斑點顯示 PMA-ionomycin 對種子 PBMC 群有顯著的刺激作用。儘管點數眾多，但均勻分散，反映出 MultiScreen^® HTS-IP PVDF 膜表面均勻的高抗體包被。滴定 PBMC 細胞數可使可視化的斑點數目相應減少。來自 CMV 血清陽性供體的未受刺激 PBMC 用作陰性對照。不出所料，這些樣本在 ELISpot 分析中沒有產生任何可辨識的 IFN-γ cytokine 反應（數據未顯示）。

圖 2. ELISpot 分析使用 0.3 µM ionomycin + 0.2 µM PMA 刺激 PBMCs 分泌 IFN-γ。顯示 CMV 血清陽性 (CMV+; 上圖) 及 CMV 血清陰性 (CMV-; 下圖) 捐贈者的結果。將 PBMC 以所示的三種不同密度（9,000、3,000 及 1,000 cells/孔）接種到 MultiScreen^® HTS-IP 篩選板中。來自血清陽性供應者的未處理 PBMCs（陰性對照）顯示的結果從 0 到 3 點不等（數據未顯示）。

接下來，比較 CMV 血清陽性和 CMV 血清陰性供體的 PBMC 對病毒特異性 IFN-γ 的反應。一組代表 pp50、pp65、IE1、IE2 和來自人類 CMV 的包膜糖蛋白 B 蛋白的多肽被用來誘導 CMV 特異性 T 細胞反應。⁵正如所料，用CMV多肽池體外處理CMV血清陽性供體的PBMC會導致細胞分泌IFN-γ（圖3）。斑點清晰明確，表明 MultiScreen^® HTS-IP PVDF 膜表面有均勻、高度的抗體包被。相比之下，用 CMV 多肽池刺激 CMV 純陰性供體 PBMC，並未顯示任何可檢測到的細胞 IFN-γ 分泌，這顯示非暴露人群的 PBMC 沒有 CMV 特異性 T 細胞或其頻率極低。

圖 3. 使用 CMV 衍生肽刺激 IFN-γ 分泌的 ELISpot 分析。檢測 CMV 血清陽性 (上圖) 和 CMV 陰性 (下圖) 供血者的 PBMC，以檢測是否存在 CMV 抗原特異性 T 細胞，這些 T 細胞在 CMV 多肽刺激下能夠分泌 IFN-γ。有 CMV 感染史的供試者 (CMV+) 樣本在 CMV 多肽池刺激下，會產生許多與分泌 IFN-γ 的 T 細胞相對應且清晰的斑點。既往未感染 CMV 的供試者（CMV-）樣本對 CMV 多肽池無法產生任何可檢測到的斑點。在 MultiScreen^® HTS-IP 過濾板的每個孔中接種不同數量的細胞。

表列結果如圖 4所示。總體而言，分泌 IFN-γ 的抗原特異性 T 細胞數量與 CMV 血清陽性供體樣本的 PBMC 播種總數相關。在播種了 50,000 個 PBMC 的孔中，比較 CMV 血清陽性和 CMV 血清陰性的樣本時，觀察到 斑點的數量相差 60 倍（66 ± 13 個斑點 vs. 1 ± 1 個斑點）。圖 4B）。

圖 4a.

圖 4b.

圖 4.A)ELISpot結果定量。 B)直接比較50,000個PBMCs播種孔的點數。While donor-to-donor variability was observed, PBMCs from CMV-seropositive donors exhibited significant increases (p < 0.01) in the number of spots observed upon CMV peptide stimulation when compared to PBMCs from CMV-seronegative donors.

結論

使用 ELISpot 分析評估來自 CMV 血清陽性和 CMV 鞘陰性供體的 PBMC 在單細胞層級刺激 CMV 多肽池後產生的細胞因子。觀察到這兩個族群的 IFN-γ 光點形成有顯著差異，供體之前暴露於巨細胞病毒與 CMV 抗原特異性 T 細胞數量增加有關。此 ELISpot 分析使用 MultiScreen^® HTS-IP 濾板與 PVDF 膜進行細胞分辨與可視化。數據顯示，清晰的斑點分佈均勻，且斑點與播種的細胞數呈線性關聯，表明膜結合性強、光學性能優異，是一種穩健的檢測方法。ELISpot 分析法對使用者友善，並因其可自動化、以微孔板為基礎的形式，提供了更高通量的潛力。

參考資料

1. Czerkinsky CC, Nilsson L, Nygren H, Ouchterlony Ö, Tarkowski A. 1983. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65(1-2):109-121. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90308-3

2. Sedgwick J, Holt P. 1983. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57(1-3):301-309. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90091-1

3. Sahin U, Muik A, Derhovanessian E, Vogler I, Kranz LM, Vormehr M, Baum A, Pascal K, Quandt J, Maurus D, et al. 2020. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses. Nature. 586(7830):594-599. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2814-7

4. Compton T, Kurt-Jones EA, Boehme KW, Belko J, Latz E, Golenbock DT, Finberg RW. 2003. Human Cytomegalovirus Activates Inflammatory Cytokine Responses via CD14 and Toll-Like Receptor 2. J Virol. 77(8):4588-4596. https://doi.org/10.1128/jvi.77.8.4588-4596.2003

5. Yang F, Patton K, Kasprzyk T, Long B, Gupta S, Zoog SJ, Tracy K, Vettermann C. Validation of an IFN-gamma ELISpot assay to measure cellular immune responses against viral antigens in non-human primates. Gene Ther. https://doi.org/10.1038/s41434-020-00214-w