核黃素在細胞培養中的應用

核黃素在無血清真核細胞（包括雜交瘤和中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞）培養中的重要性和用途

核黃素，一種無血清培養基添加劑，用於生物製造、組織工程和特殊培養基：

核黃素是一種水溶性維生素，可作為黃蛋白的補助基團。它能結合重要的大分子，例如細胞培養配方中的血清白蛋白。大多數培養基都含有一定量的核黃素。

核黄素在基础细胞培养基配方中的浓度范围从最低的 MCDB 培养基中的 0.01 µM，131；以及 0.027 µM in Ames' Medium; CMRL-1066 Medium; and Medium 199 to highs of 1.33 µM 和 2.66 µM。NCTC 培養基含有 0.067 µM 核黃素。Basal Medium Eagle (BME)；Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)和Williams Medium E中核黃素的濃度為0.27 µM，與MCDB培養基、105、110和201中的0.30 µM相似。

營養混合物，Ham's F-10含有1.0 µM 的核黃素，基本上與 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)、Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 和 H-Y Medium (Hybri-Max^®) 中的含量相同。Nutrient Mixture，Ham「s F-12 含 0.1 µM 核黃素，基本上與 MCDB Medium，151 和 301；F-12 Coon」s Modification；F-12 Coon's Modification；Swim's S-77 Medium；以及 Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium 的濃度相同。

在常用的 DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50) 中，核黃素的濃度為 0.59 µM，這是用於開發專屬無血清或無蛋白質細胞培養基的起始配方，用於以中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞為基礎的異源蛋白質生物製造。這僅略高於 BGJb Medium Fitton-Jackson Modification、Click's Medium、Glascow Modified Eagle's Medium (GMEM)、McCoy's 5A Modified Medium 和 RPMI-1640 中的 0.53 µM。

無血清和無蛋白質細胞培養系統，特別是那些為異源蛋白質生物製造和組織工程而開發的系統，似乎可從添加外源核黃素中獲益，濃度範圍從 0.5 到 1.0 µM。實際的有效濃度可能取決於遞送形式、游離或結合，以及培養基的儲存和使用條件。核黃素對光敏感，並會與某些胺基酸和金屬形成毒性複合物。

核黃素在細胞培養中的化學和生物利用度，對用於生物製造異源蛋白質和組織工程的培養基的穩定性和效用起著重要的作用。有關核黃素作為細胞培養成分的更完整討論，請造訪我們的 培養基專家。

核黃素在細胞培養系統中的主要功能：

核黃素對於涉及氧化酶和脫氫酶的廣泛代謝反應非常重要。作為黃蛋白的人工基團，它能促進電子和氫原子朝氧還原的方向轉移。以下是一些重要的黃蛋白及其代謝作用的部分清單：

能量產生：

二氫脂酰脫氫酶（EC 1.8.1.4）氧化丙酮酸脫氫酶複合物中與酶結合的脂酸，並將兩個氫轉移至 NAD。

琥珀酸脫氫酶（EC 1.3.5.1）從琥珀酸轉化為富馬酸中獲得兩個氫。

維生素代謝：

• 磷酸吡哆醇氧化酶（EC 1.4.3.5）將磷酸吡哆胺和磷酸吡哆醇轉換為磷酸吡哆醛。
• 醛氧化酶使用 FAD 將醛（如吡哆醛和視黃醛）氧化成其酸形式。
• 亞甲基四氫葉酸還原酶（EC 1.7.99.5）或（EC 1.5.1.20）是葉酸代謝中一種含 FAD 的關鍵酶，可將 5,10-亞甲基四氫葉酸轉換為 5-甲基四氫葉酸。

抗氧化：

• 谷胱甘肽還原酶（EC 1.6.4.2）， 一種 FAD 酵素，還原穀胱甘肽 並幫助維持細胞的抗氧化潛能。
• 黃嘌呤氧化酶（EC 1.1.3.22）是一種 FAD 酵素，可將次黃嘌呤和黃嘌呤轉換成尿酸. 尿酸是一種重要的抗氧化劑 在體內。

脂肪酸代謝

脂肪酰基 CoA 脫氫酶是含有 FAD 的酵素，能使脂肪酸脫飽和。脫飽和是合成脂肪酸（如油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸）的一個非常重要的步驟。

核黃素的化學特性使其成為有用的無血清媒介補充劑：

核黃素的形式：

核黃素以三種主要形式存在：

• 非磷酸化核黃素 不會以假體基團納入蛋白質中。然而，它是最常用於中配方的維生素形式（利博維茲 L-15 除外），而且它存在於動物的腸道中。
• 核黃素-5'-磷酸鹽，FMN，在某些黃蛋白中起著人工基團的作用。 在體內，腸道腸細胞使用黃激酶將非磷酸化的核黃素轉換成 FMN。FMN 主要經由白蛋白轉運至肝臟。
• 核黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)：核黃素以 FMN 的形式運送到肝臟，再與黃蛋白結合，或進一步代謝為 FAD，再與黃蛋白結合。然後，核黃素主要以 FMN 和 FAD 黃蛋白的形式輸送到其他組織。

所有這三種形式的核黃素都可以接受和提供電子以及電子等價物氫。

核黃素的三種形式都可以接受和提供電子以及電子等價物--氫，這是它們融入黃蛋白後能夠促進電子轉移的基礎。核黃素幾乎完全以單磷酸和腺嘌呤二核苷酸的形式存在於細胞中。大約有 70-90% 是以黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 的形式存在。細胞在無血清和無蛋白質介質中生長的能力可能取決於它們將核黃素代謝為 FMN 和 FAD 形式的能力。

非磷酸化核黃素的一般特徵 :

• 化學名：9, D-ribitol, 6,7 dimethyl, isoalloxazine, C₁₇H₂₀N₄O₆, mol.wt. 376.4.
• 核黃素的中性溶液呈黃綠色，並顯示黃綠色螢光，在 565 奈米處具有最大強度。它在中性 pH 下的光旋轉活動性很小。
• 等電點約為 6.
• Ka=6時的解離常數。3 X 10^-12 and Ka = 0.5 X 10^-5.
• 微溶于水。1 g 溶於 3-15 L 水，視晶體結構而定。它在酒精中的溶解度比在水中低（在 27 °C 下，4.5 mg 溶於 100 ml 絕對乙醇中）。核黃素非常易溶於稀鹼，但不穩定。10 mg/ml 的溶液在 0.1 M NaOH 中會形成透明的黃色至橘色溶液。
• 當核黃素與白蛋白結合時，無法進行二重分析。
• 在中性 pH 下，色氨酸和酪氨酸可與核黃素形成穩定的電荷轉移络合物。
• 核黃素的異噁嗪分子可螯合鎘、鈷、銅、鐵、鉬、錳、鎳、銀和鋅等金屬。某些結合的金屬很容易被氧化和還原，並在自由基的形成過程中發揮作用。
• 在無光的中性溶液中穩定。對空氣和一般氧化劑穩定，並能抵抗氯氣、過氧化氫（除非同時存在亞鐵）、亞硝酸和次氯酸的氧化。

FMN 的一般特徵：

• 與白蛋白結合時不可滴定。
• 可用溶劑和沸騰從白蛋白中釋放出來
• 比非磷酸化形式更易溶解於介質中。在 pH 6.9 時的溶解度為 100 mg/mL。
• 比非磷酸化形式對光更敏感。
• 比非磷酸化核黃素對光更敏感

FAD 的一般特徵：

最豐富的形式 在體內，但通常與載體分子或黃蛋白相關。

核黃素光解：

所有三種形式的核黃素都可以被光降解。

• 核黃素會在波長低於 500 nm 的光線下分解，尤其是在 350-400 nm 的範圍內。它在陽光下極不穩定，幾小時內就會被破壞。在溫度升高時，破壞速度會更快。
• 在中性 pH 值和有氧存在的情況下，核黃素的主要分解產物是：
  • 魯米黃（6,7 二甲基-alloxazine）
  • 核黃素側鏈降解為醛和酸，如乙醛、甲醛、甲酸等

核黃素複合物與細胞毒性：核黃素複合物與細胞毒性：

核黃素在細胞培養媒體中會與各種金屬和氨基酸產生複合物。

• 核黃素在色氨酸或酪氨酸存在下被光降解時會形成過氧化氫 。核黃素也會形成過氧化氫，但程度較輕，當媒體中沒有這兩種氨基酸時。
• 核黃素：色氨酸複合物總是會導致毒性。除了過氧化氫之外，此複合物還會產生單線氫，氧化其他氨基酸，例如組氨酸、蛋氨酸和酪氨酸，造成額外的毒性物質。

低至 1 mg/mL 的 H₂O₂  已被證實會對哺乳動物細胞造成致命傷害。H₂O₂  會破壞細胞複製；造成 DNA 和 RNA 損傷、碱基破壞、單鏈斷裂、雙鏈斷裂、交聯和姐妹染色體交換。介質中含有亞鐵或亞銅離子會促進氫氧自由基的形成，導致脂質過氧化的啟動。

能增強雜交瘤、中國倉鼠卵巢 (CHO) 及其他哺乳類真核細胞在無血清培養物中生長的核黃素產品。

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