細胞培養基礎：細胞系的低溫保存與儲存

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

細胞株的冷凍保存

冷凍保存（或稱細胞凍結）的目的是儲存細胞，以避免需要將所有                     nbsp;
cell lines in culture at all times.在處理壽命有限的細胞時，這是非常寶貴的。低溫保存的其他主要優點如下：

• 降低微生物污染的風險
• 降低與其他細胞系交叉感染的風險
• 降低遺傳漂移和形態改變的風險
• 使用一致通過數的細胞進行工作

為了確保成功冷凍保存和復活各種不同類型的細胞系，我們進行了大量的開發工作。成功冷凍保存和復甦的基本原則是緩慢冷凍和快速解凍。雖然各細胞株的要求可能不同，但一般而言，細胞應以每分鐘-1 °C至-3 °C的速度冷凍，並在37 °C水浴中快速解凍3-5分鐘。

1. 培養物應該是健康的，存活率達到 90%，並且沒有微生物污染的跡象。
2. 培養物應該處於生長的對數期（這可以通過使用低於最大細胞密度的預融合培養物，以及在冷凍前 24 小時更換培養基的方法來實現）。在許多情況下，血清的使用量為 90%。
3. 使用低溫保護劑，例如 二甲基亞砜 (DMSO)。或 甘油 以幫助保護細胞，避免因形成冰晶而破裂。最常用的冷凍保護劑是 DMSO，最終濃度為 10%。然而，這並不適合所有的細胞系，例如當 DMSO 用於誘導分化時。在這種情況下，應使用甘油等替代品（有關正確冷凍保護劑的詳細資料，請參閱 ECACC 資料表）。我們提供現成的 細胞冷凍培養基 含 DMSO、甘油和含 DMSO 的無血清配方。
4. 緩慢冷凍，每分鐘降低溫度約 1 °C，使用 Nalgene Mr.Frosty Freezing Container or Corning Cool Cell Freezing Container may aid in successful cell cryopreservation.

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圖 1. 細胞冷凍保存機制。冷凍保護劑，如 DMSO 或甘油，可加入細胞培養基，作為細胞的冷凍保護劑。DMSO 可減少冰晶形成，從而防止細胞在冷凍過程中死亡。可使用約 10% v/v 的緩慢冷凍法 (每分鐘降低溫度約 1°C)，將細胞冷凍於 -80 °C (-112 °F)，或長時間儲存於液氮中。

細胞株的超低溫儲存

在有冷凍保護劑存在的情況下進行受控速率冷凍後，只要溫度保持在-135 °C以下，細胞株就可以在懸浮狀態下進行無限期的冷凍保存。這種超低溫只能透過專用的電動冷凍機或更常見的浸泡在液態或氣態氮中才能達到。其優缺點可總結如下：

Method	優點	缺點
more	缺點
Electric (-135 °C) Freezer	易於維護 溫度穩定 運轉成本低 <	需要液氮備份 機械複雜 儲存溫度相對於液氮較高
Liquid Phase Nitrogen	穩定的超低 (-196°C) 溫度 簡單且機械可靠	需要定期供應液氮 高運轉成本 液氮交叉污染的風險
	需要定期供應液氮 運行成本高 溫度波動在 -135 °C 和 -190 °C 之間

在液相氮中儲存可以保持絕對一致的最低儲存溫度，但需要使用大量（深度）的液氮，這是潛在的危險。也有文獻記載病毒病原體經由液氮介質交叉感染的案例。

對於氣相氮儲存，安瓿被放置在一個淺液氮儲槽之上，液氮儲槽的深度必須小心保持。氣相中存在垂直溫度梯度，其極端取決於所保持的液位、容器的設計以及打開容器的頻率。如果不進行定期維護，氣相儲存容器上部區域的溫度變化可能會非常大。

因儲存維護不當而造成整個電池庫損失的情況非常普遍。

所有液氮儲存容器最低限度都應包含警報器，以警告液氮液位過低，並應持續監控溫度和發出警報。氣相儲存系統尤其如此。散裝液氮儲存容器在重新供給之前，不應讓其少於一半的容量。這可確保至少漏掉一次液氮輸送，而不會造成災難性的後果。強烈建議貴重的細胞庫應儲存在第二個地點以作備用。ECACC 可為此目的提供安全儲存服務。

圖 2. 常用於細胞冷凍保存的液氮儲存槽。

細胞線庫存控制

所有超低溫儲存容器都應包括一個貨架/庫存系統，該系統旨在組織內容物，以便於定位和檢索冷凍的安瓿：

• 每個安瓿都應獨立標籤，使用耐液氮標籤，標明身份、批號、通過號和凍結日期。
• 每個安瓿的位置最好記錄在電子數據庫或試算表上，但也可記錄在紙質儲存計劃上。
• 應設立控制系統，確保在未更新記錄的情況下，不得存放或提取安瓿。

液氮安全注意事項

一般安全問題

重要的是，員工必須接受過使用液氮和相關設備（包括需要安全排氣的儲存容器和可能需要填充的容器）的培訓。與所有實驗室程序一樣，在處理氮氣時應穿戴個人防護裝備，包括全面罩和隔熱手套，此外還應穿戴實驗室外套，最好還穿戴防潑濺塑料圍裙。適當的訓練和防護設備的使用可將凍傷、灼傷和其他不良事故的風險降至最低。

窒息的風險

最重要的安全考量是當逸出的氮氣汽化並取代大氣中的氧氣時，可能發生窒息的風險。這一點非常重要，因為氧氣耗盡可在毫無警告的情況下迅速導致失去意識。因此，液氮冷藏箱應放置在通風良好的地方，以將此風險降至最低，並應進行有計劃的預防性維護。大容量倉庫應裝有低氧警報系統。

專用液氮儲存區的預防措施

• 使用氧氣警報設定為 18% 氧氣 (v/v)
• 員工訓練 - 員工應接受訓練，在聽到警報時立即疏散該區域，直到氧氣恢復到正常水平 (~ 20% v/v)
• 員工在處理液氮時應成對工作
• 禁止在正常工作時間以外使用氮氣
• 如果可能，應安裝機械通風系統