簡介
色譜方法的靈敏度可用其檢測限 (LOD) 來描述。LOD 通常定義為使用給定的分析方法可以可靠檢測到的成分的最小檢測量或濃度。換句話說，LOD 是測試樣本中可可靠區分為零的分析物最低量或濃度。實際上，「零 」是從測量不含該成分的樣品（空白樣品）中得到的。色譜法中 LOD 的通常估算方法是測量信噪比 (S/N)。色譜信號值由分析物峰的高度和雜訊值決定。雜訊值可由雜訊的標準偏差或所謂的峰峰值得出。後者是透過注入空白樣品，並利用基線雜訊中最高點與最低點之間的差異來決定，而基線雜訊中最高點與最低點之間的差異就是分析峰洗脫的時間。全球公認的分析物檢測標準是信噪比等於或高於 3。在最低濃度下進行多次（最少 3 次）測量，所有測量結果仍顯示可顯著偵測到化合物 (S/N≥3)，該濃度才可取為檢測限。檢測限是研究人員在考慮其方法的有效性時所尋找的最重要值。
降低基線雜訊
在許多情況下，所使用的溶劑和添加劑的類型及其在洗滌液中的純度是造成基線雜訊的主要原因。TEA 或 TFA 等添加劑可能會因為其相對較高的 UV 吸光度而增加雜訊。如果是在低於 220 nm 的低波長下進行檢測，這一點尤其重要。首先，檢查在較長波長下是否也能可靠地進行檢測。仔細檢查洗滌液的選擇，例如甲醇在低波長下有較高的吸收率，這會使較小的峰值難以檢測。此外，還應避免檢測器和溶劑在白天出現不受控制的溫度漂移。其次，即使是合成後或因色谱柱出血而產生的微量雜質，也會大大增加基線雜訊。因此，最好先安裝新的保護柱，必要時也安裝新的分離柱，然後比較所得的色譜圖。另一個需要考慮的因素是 HPLC 系統本身。可檢查系統中是否有任何污染或空氣、泵的性能（壓力波動）、UV 燈管的使用壽命以及檢測器池的清潔度 - 所有這些都會造成基線雜訊。最後，溶劑混合裝置的大小。尺寸較小的溶劑混合單元對死體積的影響較小，但基準噪音較高，通常是因為混合不夠完美。較大尺寸的溶劑混合單元可提供較佳的混合效果，但也會造成較大的死音量。
增加信號強度
減少色谱柱內徑 (ID)
HPLC 色譜柱的 ID 會影響色譜柱中的樣品濃度。樣品的稀釋程度與色譜柱的橫截面積成正比，因此內徑較小的色譜柱稀釋程度較低。只要直徑減少一半，檢測器中的濃度就會提高 ~4 倍。請記住，色譜柱的容量也會同時減少，因此必須調整注入量和流速。
提高色谱柱效率
降低粒度可提高灵敏度，因为色谱峰更窄、更高。使用 Ascentis® Express 之類的超微多孔顆粒 (SPP) / 核殼柱是最佳選擇。這些柱子可以模擬直徑較小 (效率較高) 的顆粒，而不會增加背壓。例如，用 2.7 µm 的表面多孔顆粒取代完全多孔的 3 µm 顆粒填料色譜柱，幾乎可將色譜柱效率提高一倍。由於效率較高，峰值會更窄更高，藉此靈敏度也會提高。
系統效率
為了達到高效率的分離，將儀器的死体积降至最低非常重要。這可以通過優化整個 HPLC 系統，使用較小的內徑和/或較短的連接毛細管、較小的進樣單元和較小的檢測池來實現。
最佳流速
由此產生的峰高/效率也受到正確流速選擇的影響。過高的流速（非常窄的峰）、過低的檢測頻率可能會導致檢測過程中的損失，因為檢測器根本沒有足夠的"時間"來合理地檢測被分析物質（數據點太少）。此外，還應考慮 van Deemter 圖：嘗試在最佳條件下操作，選擇效率最大（理論板高度最小）的最佳流速。
色譜柱出血
分離柱的選擇也會影響雜訊水平。選擇與色譜柱的最佳溫度、pH 值、溶劑相容性、工作範圍相匹配的色譜條件，將潛在的出血影響降至最低。峰尾。選擇最佳的色譜柱和色譜條件，以獲得對稱的峰值。必須對方法條件進行優化，以選擇最合適的緩衝劑、pH 值，必要時還需添加添加劑。例如，最佳 pH 值應為分析物 pKa 值的 +/- 2 個 pH 單位，以便處理非離子化形式。
結論
為了提高色譜方法的靈敏度，請選擇一個或幾個選項來降低基線雜訊和/或進行建議的改進以提高信號強度。
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