HPLC 技巧與竅門：流動相準備第 2 部分 - 緩衝液
Dr. Egidijus Machtejevas, Lead Expert, Analytical Science Liaison
Merck
在分析含有可電離化合物的樣品時，緩衝液可能是控制 HPLC 分離保留的最重要變量之一。流動相的 pH 值決定了可離子化化合物（分析物和基質）是處於離子化還是非離子化狀態。反相 (RP) 色譜中的離子化物質總是比非離子化物質更早從色谱柱中洗脫出來。改變 pH 值也可增加選擇性，以有效分離緊密洗脫或重疊的峰。運行間 pH 值的變化會導致分離不一致。緩衝液可防止 pH 變化。因此，在分析可離子化物質時，從緩衝物種、離子強度和 pH 來說，選擇適當的緩衝液是 HPLC 方法開發中最關鍵的步驟。
選擇 LC 緩衝液的訣竅
緩衝液的選擇
為應用選擇合適的緩衝液是由緩衝液的特性所決定的，例如 pKa、pH 範圍和紫外截止值。一般而言，緩衝液的 pH 值應在其 pKa 值的 +/- 1 個單位之內。在此範圍內，緩衝劑可抵抗任何刻意改變 pH 值的嘗試。當 pH 值等於其 pKa時，緩衝劑的容量達到最大。還需要考慮紫外截止值，因為檢測波長不應會干擾緩衝劑的吸光度（顯著吸光度：三氟乙酸 <220 nm；甲酸、乙酸 <240 nm）。對於可離子化的分析物，使用 pH 值與分析物 pKa 相差至少 2 個單位的緩衝液，才能獲得最佳結果。如果流動相的 pH 太接近被分析物的 pKa，可能會因為樣品中同時存在兩種物質而觀察到分離峰或肩峰。對於多種可電離的分析物，最好選擇一個pH值，所有的分析物都以相同的形式存在，無論是電離或非電離。
測量緩衝液的 pH 值
緩衝液的 pH 值是指加入有機流動相部分之前水相部分的 pH 值。有機溶劑的加入會使 pH 上移或下移（同樣緩衝液的 pH 移動應該一致）。知道緩衝液在有機介质中的確切 pH 值並不那麼重要，但有一個一致的 pH 值卻很重要（因為您的分析物的 pKa 也是在水相中測定的，而我們也不知道個別 pKa 的偏移）。
化學純度
HPLC實驗中使用的流動相添加劑（緩衝液、鹽、酸和鹽基）和有機溶劑的品質/純度必須與檢測器靈敏度和洗脫方案相適應。
化學相容性
緩衝劑成分和流動相 pH 值的選擇必須與色谱柱外殼材料、固定相的性質以及 LC 儀器的不同部分（泵、管子等）相匹配，以防止其中任一相的腐蝕或降解。
MS 相容性
將無機緩衝鹽導入質譜儀，很快就會使系統產生污垢。合適的揮發性緩衝劑有醋酸銨、甲酸銨和檸檬酸銨，pH 調節劑如甲酸和醋酸應被用來控制 pH 並幫助 LC-MS 的電離。
緩衝液的溶解性
理想情況下，緩衝液應完全溶於水 (RP 方法)，且在分析過程中與所選的有機溶劑混合時不應析出。因此，緩衝液濃度必須小心選擇，以避免在有機溶劑中濃度較高時出現沉澱。如果忽略這一點，可能會造成泵的操作問題，並導致 HPLC 色譜柱阻塞或背壓上升。
Buffer Ionic Strength（緩衝液離子強度）
如果分析物與固定相之間存在離子相互作用，則必須選擇緩衝液的離子強度，使化合物得以洗脫。緩衝液所需的離子強度取決於固定相。除了洗脫強度外，緩衝液的黏度對其是否適合用於 HPLC 分析也有重要影響。
緩衝劑濃度
理論上，應選擇能提供可重複結果的最低濃度。濃度越高，極性分子的洗脫速度越快。一般而言，緩衝液濃度不應低於 5 mM。低於此濃度，溶液可能無法發揮緩衝作用（取決於分析物濃度和緩衝能力）。提高緩衝劑濃度會增加黏度和緩衝劑沉澱的風險，進而增加色譜柱背壓。
通常，濃度應保持在 5 到 100 mM 的範圍內。高於 100 mM 的礦物鹽緩衝液會更快地磨損泵的活動部件，因此建議安裝背封清洗器。
可以看出，緩衝液在大多數 HPLC 分離中起著關鍵作用。方法開發通常需要謹慎選擇緩衝液，並在製備過程中充分注意。因此，需要牢記的一般規則是： 緩衝溶液必須均勻、清澈且不含任何微粒。如果儲存緩衝液，請記住緩衝液的壽命是有限的，因此請考慮每天準備。
請參閱 HPLC Method Development in 1.5 Days using the Selectivity Concept
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