使用 LC-UV/MS 進行萃取物研究 - 使用萃取物和浸出物的認證參考物質 (CRM) 混合物，對一次性使用系統的未知萃取物進行高效鑑定和定量。

Tim Mueller, Scientist Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, Marc Gemeinder, Project Manager for Extractables and Leachables Studies, Saskia Haehn, Manager Extractables and Leachables Laboratory, Matthias Nold, Product Manager Reference Materials

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 12

在第 8 期 Analytix Reporter 雜誌中，我們介紹了一種 GC/MS 方法來檢測一次性使用設備中的可萃取物和可浸出物 (E&L)。此外，我們也展示了在 GC 中使用 TraceCERT^® 可萃取物和可浸出物認證參考物質 (CRM) 混合物的便利性，可有效地檢測和量化最常見的可萃取物。

由聚合物製成的單次使用系統 (SUS) 是製造或處理藥物的常用元件。

由聚合物製成的單次使用系統 (SUS) 是製造或處理藥物的常用元件，這種直接接觸可能會導致聚合物材料元件滲入產品而污染藥物。

為了管理此風險，瞭解可能從材料中遷移的化合物（可萃取研究）以及在特定條件下發生此類遷移的數量（可浸出研究）至關重要。

可溶出物：從任何產品接觸材料（例如：一次性使用系統）遷移到藥物配方中的化學化合物、

可萃取物：通常在極端條件下（苛刻的溶劑、過長的時間和溫度）從任何產品接觸材料中提取的化學化合物；可提取物檔案代表最壞情況下的可浸出物檔案

單次使用系統 (SUS)：製藥過程中使用的生物製程一次性聚合設備

• 優點：彈性、無需清潔驗證、低投資、無交叉污染
•  SUS 的範例：生物反應器、拋棄式過濾器或管路

正如 BPOG (BioPhorum Operations Group) 指南¹和 USP <665>聚合物成分和系統指南²（草案版）所述，應使用各種溶劑和培養時間進行可萃取物的調查，並應用各種分析方法對萃取物進行分析。

液相色譜-紫外光光譜/質譜法（LC-UV/MS）是分析非揮發性可萃取物（如添加劑、雜質、聚合物成分或降解產物）的理想方法。選用 UV 和 MS 是為了檢測範圍廣泛的可萃取物。

為了方便進行此類分析，我們針對 LC-UV/MS 研究中常見的 21 種可萃取物開發了 CRM 混合物。這種 CRM 混合物不僅有助於快速鑒定未知可提取物，還可用於定量，並可溯源至 NIST SRM。由於混合物包含多種物質類別，因此也適用於檢查分析方法，以降低忽略潛在可萃取物的風險。混合物中的 21 種化合物列於 表 2。相應的單組分參考物質在下面的  「相關產品 」中列出。

下面將介紹一個應用，使用 LC 混合液的萃取物和浸出物篩選標準，來鑒定和定量過濾器萃取研究中的主要萃取物。

萃取物測試的LC方法

表1中概述了一次性使用設備（過濾器）萃取物研究中應用的儀器參數。根據 BPOG 規範¹，在 C18 色譜柱（Ascentis^® C18 色譜柱：15 cm x 2.1 mm，3 µm）上進行分離。在 40 °C、50%乙醇萃取 24 小時後，取代表性樣品。樣品與標準混合液以一個順序運行。

表 1. 實驗條件

儀器：	Agilent Infinity II, QToF 6546
柱：	Ascentis® C18, 15 cm x 2.1 mm, 3 μm (581302-U)
移相：	Time (min)	%A	%B
0	100	0
1	100	0
15	0	100
25	0	100
25.1	100	0
30	100	0。5 mL/min
體溫：	40°C
偵測器：	DAD，191 - 400 nm；MSD，全掃描，m/z 75-1500
注入：	1.單次使用過濾器的萃取液 (24 小時萃取 使用 50% 乙醇) 2.LC 用可萃取物及可浸出物篩選標準 (95636)，10 mg/L 於乙腈中

Results & Discussion

可提取物和可浸出物篩選標準液相色譜圖見圖1-3(UV, ESI pos, ESI neg, 峰ID見表2)。所有 21 種參考化合物均能被 UV-MS 檢測器檢測到，且幾乎完全分離。其中16種參考化合物可用UV (220 nm)檢測，13種參考化合物可用ESI正離子檢測，14種參考化合物可用ESI負離子檢測。通過保留時間和m/z比值的匹配，季戊四醇四(3,5-二叔丁基-4-羥基氫化肉桂酸酯)(Irganox 1010)被鑒定為一次性過濾器萃取過程中的主要可萃取物(圖4)。根據UV (220 nm)、ESI正或ESI負色谱圖，可對LC的可萃取物和可浸出物篩選標準中的季戊四醇四(3,5-二叔丁基-4-羥基氫化肉桂酸)(Irganox 1010)峰進行定量分析。

圖 1. LC 可萃取物和可浸出物篩選標準，紫外線 (220nm)，10 mg/L 乙腈。

圖 2. LC 可萃取物和可浸出物篩選標準，ESI 陽性，10 mg/L 乙腈。

圖 3. LC 可萃取物和可浸出物篩選標準，ESI 陰性，10 mg/L 乙腈。

圖 4. 一次性使用設備萃取的代表性樣品。上圖：50% EtOH 樣品，下圖：50% EtOH 樣品：LC 的可萃取物和可浸出物篩選標準

表 2. 化合物的峰 ID、選擇離子和保留時間

CAS	m/z	。最顯著的加合物	RT[min]
ESI pos	ESI neg
1	ε-Caprolactam	105-60-2	C6H11NO	136.0728	極弱	[M+H]+	-	5.43
2	二苄胺	103-49-1	C14H15N	198.1279	yes	[M+H]+	-	6.23
3	苯甲酸	65-85-0<	C7H6O2	121.0284	yes	-	[M-H]-	8.48
4	2-巯基苯並噻唑 (2-MBT)	149-30-4	C7H5NS2	167.9931 165.9788	是	[M+H]+	[M-H]-	9.36
5	雙酚 A (BPA)	80-05-7<	C15H16O2	227.1077	是	-	[M-H]-	11.1
6	2-乙基己酸	149-57-5<	C8H16O2	143.1082	no	-	[M-H]-	12.1
7	雙(4-氯苯基)砜	80-07-9	C12H8Cl2O2S	308.9519	yes	[M+H]+	-	12.5
8	3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl alcohol	88-26-6	C15H24O2	259.1672 235.1705	是	[M+Na]+	[M-H]-	12.7
9	2,4-Di-tert-butylphenol	96-76-4	C14H22O	205.1597	是	-	[M-H]-	14.2
10	2-(2-羥基-5-甲基苯基)苯並三唑	2440-22-4	C13H11N3O	226.0972 224.0826	是	[M+H]+	[M-H]-	14.5
11	丁基羥基甲苯 (BHT)	128-37-0	C15H24O	219.1754	是	-	[M-H]-	14.9
12	1,3-Di-tert-butylbenzene	1014-60-4	C14H22	-	是	-	-	15.3
13	油醯胺	.301-02-0	C18H35NO	282.2795 280.2643	非常弱	[M+H]+	[M-H]-	15.6
14	棕榈酸	57-10-3<	C16H32O2	255.2331	no	-	[M-H]-	16.1
15	鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (DEHP)	117-81-7	C24H38O4	391.2839	yes	[M+H]+	-	16.0
16	硬脂酸	57-11-4<	C18H36O2	283.2644	no	-	[M-H]-	16.5
17	桉酰胺	112-84-5	C22H43NO	338.3417	非常弱	[M+H]+	-	16.5
18	三(3,5-二叔丁基-4-羥基苄基)異氰脲酸酯	27676-62-6	C48H69N3O6	806.5084	yes	[M+Na]+	-	16.1
19	季戊四醇四剋 (3,5-二叔丁基-4-羥基氫化肉桂酸酯)	6683-19-8	C73H108O12	1199.7770 1175.7726	是	[M+Na]+	[M-H]-	16.7
20	三(2,4-二叔丁基苯基)磷酸酯	95906-11-9	C42H63O4P	685.4365 661.4378	是	[M+Na]+	[M-H]-	17.8
21	十八烷基-3-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基) 丙酸酯	2082-79-3	C35H62O3	553.4597 529.4624	是	[M+Na]+	[M-H]-	19.8

結論

所示示例展示了可萃取物和可浸出物篩選標準在 LC 分析中的適用性和價值，可可靠分析一次性使用設備產生的最常見可萃取物。所示的 LC-UV/MS 方法使用 Ascentis^® C18 色譜柱，對混合液中的 21 種成分進行了可靠的鑑定和定量。

參考資料

1. 2017. Ding et al. Standardized Extractables Testing Protocol for Single-Use Systems in Biomanufacturing. [Internet]. Pharmaceutical Engineering. Available from: https://ispe.org/pharmaceutical-engineering/ispeak/standardized-extractables-testing-protocol-single-use-systems-0

2. USP <665> Plastic Materials, Components and Systems Used in the Manufacturing of Pharmaceutical Drug Products and Biopharmaceutical Drug Substances and Products, third draft, published on March 1, 2019 by the USP. [Internet].