使用 2-D Quant Kit 進行蛋白質測定

2-D Quant Kit 專為準確測定電泳樣品中的蛋白質濃度而設計。蛋白質被定量沉澱，而干擾物質則留在溶液中。在 2-D Quant Kit 程序中形成的顏色密度與蛋白質濃度成反比，蛋白質的線性反應範圍為 0-50 µg，體積範圍為 1-50 µL。本程序與 表 13中列出的常用樣品製備試劑相容。

表 13. 化合物測試相容性。

化合物	濃度
SDS	2% (w/v)
CHAPS	4% (w/v)
Triton X-100	1% (w/v)
Pharmalyte pH 3-10	2% (v/v)
IPG Buffer pH 3-10 NL	2% (v/v)
Tris	50 mM
EDTA	10 mM
DTT	1% (65 mM)
2 巯基乙醇	2% (v/v)
尿素	8 M
Thiourea	2毫升
甘油	30% (w/v)

圖 15. 2-D Quant Kit 蛋白質分析排除了樣品溶液成分的干擾

Protocol: 2-D Quant Kit

提供的組件
沉澱劑、助沉澱劑、銅溶液、顯色試劑 A、顯色試劑 B、牛血清白蛋白 (BSA) 標準溶液。

需要但未提供
微量離心機、微量離心管（2 mL）、漩渦混合器、可見光分光光度計、分光光度計電池。初步注意事項 在開始程序之前，先將 100 份顏色試劑 A 與 1 份顏色試劑 B 混合，製備工作顏色試劑，每個單獨檢測需要 1 mL 工作顏色試劑。

1. 使用 2 mg/mL BSA 標準溶液製備標準曲線（0-50 µg）。
2. 製備含有 1-50 µL 待檢樣品的微離心管（一式兩份）。測定的有效範圍為 0.5-50 µg。
3. 在每個微離心管（包括含有 BSA 標準溶液的微離心管）中加入 500 µL 沉澱液。攪拌並在室溫孵育 2-3 分鐘。
4. 離心（至少 10 000 × g）5 分鐘。
5. 移除上清液。簡短離心，使剩餘上清液至管底。

快速進行以避免重懸浮或分散膠粒。

1. 在每個試管中加入 100 µL 銅溶液和 400 µL 蒸餾水或去離子水。渦旋溶解沉澱的蛋白質。

徹底渦旋，確保沉澱物完全重悬。

在室溫下培養 15-20 分鐘。

使用 Ultrospec1100 pro UV/Visible Spectrophotometer 等分光光度計在 480 nm 處讀取每個樣品和標準品的吸光度。

將標準物的吸光度與蛋白質的數量進行對比，生成標準曲線。

通過與標準曲線進行對比，估算樣品的蛋白質濃度。